AC092894.1下调促进结直肠癌奥沙利铂耐药

实验方法：RT‑qPCR，Western blotting，CCK‑8，克隆形成实验，流式，裸鼠异种移植模型，免疫组化，RNA pull‑down，RIP‑qPCR。

  奥沙利铂耐药是一个复杂的过程，是结直肠癌治疗过程中最不利的因素之一。lncRNAs是近年来出现的治疗耐药的新型分子，但其介导的具体分子机制尚不清楚。AC092894.1表达在奥沙利铂诱导的耐药CRC细胞中显著下调。体内外实验表明，AC092894.1具有逆转药物耐药的作用。机制研究表明AC092894.1作为支架分子，通过USP3介导AR的去泛素化，从而增加RASGRP3的转录。最后，持续激活MAPK信号通路可诱导CRC细胞凋亡。总之，本研究确定AC092894.1是CRC化疗耐药的抑制因子，并揭示了靶向AC092894.1/USP3/AR/RASGRP3信号轴是治疗奥沙利铂耐药的一种新选择。

技术路线

结果

1）AC092894.1在CRC细胞和对奥沙利铂耐药的患者组织中的表达降低

  为了研究lncRNAs在结直肠癌奥沙利铂耐药中的作用，我们首先通过连续给药长达6个月的方法构建了奥沙利铂耐药CRC细胞LoVo (LoVo- OxR)。通过细胞活力测定比较LoVo-OxR及其亲本细胞对奥沙利铂的敏感性，并计算半最大抑制浓度(IC50)(图1A)。我们对LoVo和LoVo-OxR的lncRNA进行全基因组测序分析，火山图显示差异基因分布(图1B)，并在测序结果中筛选出两个下调最显著的lncRNA。通过RT-qPCR检测，AC092894.1基因下调最为显著(图1C)。AC092894.1在奥沙利铂耐药CRC临床样本中显著下调，提示AC092894.1基因可能与患者奥沙利铂耐药有关(图1D)。在40例CRC患者中，AC092894.1高表达的患者被观察到预后良好(图1E)。使用我们团队构建的CRC类器官，AC092894.1的表达被奥沙利铂显著下调(图1F, G)。我们使用6个暴露于不断增加浓度的奥沙利铂的CRC细胞系，并注意到HT-29和RKO与其他CRC细胞系相比具有天然抗性，而LoVo表现出最高程度的敏感性(图1H)。此外，我们采用RT-qPCR检测AC092894.1的表达随着耐药的增加而降低(图1I)。

图1

2）CRC细胞中奥沙利铂敏感性的增加与AC092894.1的异位过表达有关

  构建AC092894.1过表达质粒，分别转染LoVo-OxR和HCT116-OxR细胞。对其过表达效率的检测显示其可稳定表达(图2A)。细胞活力测定显示，过表达AC092894.1后，奥沙利铂对耐药CRC细胞的作用随着奥沙利铂浓度的增加而增强(图2B, C)。我们在凋亡实验中发现了一个有趣的现象，AC092894.1过表达仅在奥沙利铂暴露后才促进耐药CRC细胞的化学敏感性。相反，在暴露于对照溶剂的耐药CRC细胞中过表达AC092894.1不会促进耐药CRC细胞的化学敏感性(图2D, E)。然后，我们在菌落形成实验中发现了相同的模式，其中AC092894.1的过表达仅在暴露于奥沙利铂的耐奥沙利铂CRC细胞中显著促进了化学敏感性(图2F, G)。Western blotting分析显示，过表达AC092894.1可显著促进奥沙利铂治疗后凋亡标志物C-PARP的高表达(图2H)。

图2

3）CRC细胞对奥沙利铂的敏感性通过AC092894.1的下游效应分子RASGRP3增加

  为了进一步探索AC092894.1促进CRC细胞耐药的分子机制，我们用RNA-seq分析了稳定表达的AC092894.1细胞及其对照载体细胞。火山图显示了差异表达的基因(图3A)。KEGG富集分析显示，AC092894.1过表达后的大部分差异表达基因参与TNF信号通路和MAPK信号通路(图3B)。我们的结果还显示，过表达AC092894.1激活了CRC耐药细胞中的MAPK信号通路(图3C)。基于这些结果，AC092894.1可能作为MAPK信号通路的一部分参与了奥沙利铂耐药的发生。为了研究AC092894.1是如何参与调控MAPK信号通路的，我们在RNA-seq数据库中筛选了AC092894.1过表达与对照之间MAPK信号通路中差异表达的关键基因。此外，这些基因被实时定量PCR验证。结果显示，AC092894.1过表达后，RASGRP3在mRNA水平上显著上调。LoVo-OxR和HCT116-OxR的验证也显示了RASGRP3蛋白水平的显著上调(图3D, E)。推测RASGRP3可能是AC092894.1的下游效应分子。通过实时荧光定量PCR，我们发现RASGRP3在奥沙利铂耐药CRC患者中显著下调(图3F)。

图3

4）AC092894.1通过在转录水平调控RASGRP3的表达，介导CRC细胞的化疗耐药

  为了确定RASGRP3对于AC092894.1在CRC细胞中介导奥沙利铂耐药是否至关重要，我们分别在LoVo-OxR (AC092894.1)和HCT116-OxR (AC092894.1)细胞中敲除RASGRP3(图4A)。细胞活力、凋亡和菌落形成的结果表明，敲除RASGRP3可恢复耐药CRC细胞对奥沙利铂的耐药(图4B-F)。此外，我们发现过表达AC092894.1通过双荧光素酶报告基因促进了RASGRP3的启动子活性(图4G)。这一结果表明，RASGRP3表达的改变是由转录水平的改变引起的。

图4

5）AR作为转录因子促进RASGRP3的转录并介导化疗耐药

  我们一直在应用PROMO数据库来预测RASGRP3，因为我们可以研究已经发生的转录变化。我们发现GATA-2、RXRα、FOXP3和AR可能是它们潜在的转录因子(图5A)。进一步分析发现AC092894.1过表达后，LoVo-OxR和HCT116-OxR细胞中只有AR上调(图5B)，提示AR可能是影响RASGRP3转录的关键因素。为了探索AR是否也介导耐药，我们分别在LoVo-OxR (AC092894.1)和HCT116-OxR (AC092894.1)细胞中敲除AR(图5C)。如图5D-G所示，敲除AR可增强耐药CRC细胞对奥沙利铂的耐药。进一步发现，AR的下调可恢复RASGRP3 mRNA水平和启动子活性(图5H, I)。实时定量PCR显示，在奥沙利铂耐药CRC患者中，AR表达显著降低(图5J)。

图5

6）AC092894.1作为支架分子招募USP3促进AR去泛素化

  为了探究AC092894.1与AR的关系，我们假设AC092894.1通过与AR直接结合来调控AR。我们使用生物素化AC092894.1探针及其反义探针进行RNA敲除，然后进行Western blotting分析。原理图见图6A。结果显示AC092894.1可以捕获AR的特征，但反义探针并没有富集AR(图6B)。随后，我们通过RIP实验发现，与IgG相比，AR抗体可以特异性捕获AC092894.1(图6C)。这些结果证明AC092894.1可以与AR相互作用。为了探索AC092894.1是否可以在mRNA水平上影响AR的表达，我们通过RT-qPCR检测了LoVo-OxR和HCT116-OxR细胞中AR的表达，发现AC092894.1不能在mRNA水平上调控AR(图6D)，因此AC092894.1可能通过蛋白水平或其他方式影响AR的表达。LncRNAs常被报道作为引导物、诱饵或支架参与信号转导。因此，我们大胆推测AC092894.1是否具有支架分子的功能。接下来，我们对RNA下拉蛋白进行了质谱分析。质谱与去泛素酶预测数据库Ubibrowser的交叉分析表明，USP3可能是一个潜在的关键分子(图6E)。通过RNA下拉实验，我们发现AC092894.1可以捕获USP3，但其反义探针不能捕获USP3 (图6F)。接下来，我们通过RIP实验发现AC092894.1在USP3抗体上的富集程度明显高于IgG抗体。这进一步证明了AC092894.1与USP3的结合(图6G)。此外，我们发现AC092894.1过表达后，USP3在LoVo-OxR和HCT116-OxR细胞中的表达没有明显变化(图6H)。我们发现过表达AC092894.1促进了USP3与AR的共免疫沉淀相互作用(图6I)。敲低USP3促进了AR的蛋白降解(图6J)。进一步的实验发现，过表达AC092894.1促进了AR的去泛素化(图6K)。这些结果表明，AC09894.1可以作为将USP3募集到AR的支架分子，促进其去泛素化，从而增加AR的蛋白质水平。

图6

7）AC092894.1异位过表达增加体内奥沙利铂敏感性

  为了研究AC092894.1在体内对CRC耐药的调节作用，我们将HCT116-OxR细胞皮下注射到裸鼠体内。小鼠皮下肿瘤形成后，腹腔注射奥沙利铂(ip, 5mg /kg / d)。肿瘤大小每5天测量一次，而受试者每3天接受DMSO (0.1 mL/kg)或乙醇(0.1 mL/kg)(图7A)。过表达AC092894.1增加了CRC细胞对奥沙利铂的敏感性，导致肿瘤密度降低，体积变小(图7B-D)。对于小鼠肿瘤，采用RT-qPCR进行验证(图7E)。免疫组化实验显示AC092894.1过表达后p-p38和RASGRP3的表达增加(图7F)。总之，这些发现表明AC092894.1可能是克服CRC患者奥沙利铂耐药的有效治疗靶点。

图7

结论：我们发现了一个新的lncRNA AC092894.1，它在奥沙利铂耐药CRC中显著下调。机制研究表明AC092894.1可通过招募USP3促进AR的去泛素化。增强AR的稳定性可以进一步促进RASGRP3的转录，从而激活MAPK信号通路，最终导致CRC细胞的化疗敏感性。我们的研究结果表明AC092894.1对奥沙利铂的拮抗至关重要，并认识到AC092894.1在CRC中的潜在治疗用途及其下游影响。

参考文献：Zheng Z, Wu M, Li H, Xu W, Yang M, Pan K, Ni Y, Jiang T, Zheng H, Jin X, Zhang Y, Ding L, Fu J. Downregulation of AC092894.1 promotes oxaliplatin resistance in colorectal cancer via the USP3/AR/RASGRP3 axis. BMC Med. 2023 Apr 3;21(1):132. doi: 10.1186/s12916-023-02826-6.