邪恶推手：apCAFs新亚群诱导Treg细胞扩增

实验方法：免疫组化，RT-qPCR，WB，小鼠模型，谱系追踪测定，肿瘤类器官，流式分选，细胞共培养，Treg抑制实验，RNA测序，单细胞RNA测序及其生信分析

最新研究发现了一种独特的癌症相关成纤维细胞（CAF）群体，称为抗原呈递CAFs（apCAFs），其特征是主要MHC II类分子的表达，表明其具有调节肿瘤免疫方面的功能。本研究通过整合多项单细胞RNA测序和进行稳健的谱系追踪分析，发现apCAFs来源于间皮细胞；在胰管腺癌（PDA）进展过程中，间皮细胞通过下调间皮特征并获得成纤维细胞特征形成apCAFs，这一过程由IL-1和TGF-β诱导；apCAFs以抗原特异性方式直接连接并诱导初始CD4+ T细胞分化为调节性T细胞（Tregs）；靶向间皮细胞标志物mesothelin可有效抑制间皮细胞向apCAF转化和apCAF诱导的Treg形成。

技术路线：

主要实验结果：

1、apCAFs来源于间皮细胞

作者之前通过scRNA-seq分析了多种PDA的基因工程小鼠模型（GEMMs）（正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC [Kras^LSL-G12D/+; Trp53 ^fl/fl; Pdx1^Cre/+]），并确定了正常胰腺和早期PDA中的三个成纤维细胞群（FB1、FB2和FB3）以及后期PDA中的两个群（FB1和FB3）。为了解成纤维细胞在这些模型之间的关系，将来自正常胰腺、早期KIC、晚期KIC、晚期KPC和晚期KPfC的所有成纤维细胞投影到tSNE图上，并进行聚类（图1A），并鉴定到成纤维细胞的四种分子亚型（图1B），其中FB1和FB2在此前的报道中已有描述，但此前鉴定的FB3亚群在这里聚为了3类，所以命名为FB3和FB3B，其中FB3B在所有晚期GEMMs中都有特异性扩增（图1C）。然后研究FB3A和FB3B的转录谱，发现每个亚型都以MHC II通路和间皮细胞基因的表达为特征（图1D-1E）。但与FB3A相比，FB3B的间皮标志基因表达水平较低，炎症和肌纤维母细胞性基因表达水平升高（图1D，1F）。这些数据表明FB3A和FB3B为间皮细胞，FB3A为正常间皮细胞，FB3B为成纤维表型的间皮细胞。

为了解这些间皮细胞相关群体之间的关系，作者整合了三个成纤维细胞数据集，并使用UMAP进行聚类和降维，结果显示来成纤维细胞分为11个不同的集群（图1G）。为识别间皮细胞簇，生成MHC II通路和间皮细胞基因的UMAP图，发现聚类7和9表达这些特征基因（图1H）。根据数据集的来源强调成纤维细胞的分布，以了解FB3A、FB3B、apCAFs和正常间皮细胞之间的关系（图1I）。发现合并数据中的聚类7（图1G）具有与FB3A相同的特征，聚类9与FB3A相同，提示簇7代表正常间皮细胞，簇9代表成纤维细胞间皮细胞群。因此，本研究中将簇9定义为apCAFs，簇7定义为正常间皮细胞。

图1 scRNA-seq综合分析正常间皮细胞与apCAFs的关系

2、在PDA进展过程中，间皮细胞扩张并促进粘连形成

收集3只KPfC小鼠的晚期肿瘤（PDA1、PDA2、PDA3），消化成单细胞悬液，分析apCAFs的比例（图2A），发现所有三种肿瘤都由apCAFs组成，其百分比与iCAFs和myCAFs相当。为追踪PDA进展过程中间皮细胞的命运，作者使用CFSE燃料进行谱系追踪测定，将CFSE注射到野生型小鼠的腹腔内，并在2天后获取胰腺，发现正常胰腺的间皮被细胞示踪染料标记（图2B），相反，在60天大的KIC或KPfC荷瘤小鼠身上进行了同样的检测，并且发现CFSE标记的细胞从间皮区域渗入到肿瘤基质中（图2B）。为确保CFSE信号是间皮细胞特异性的，将CFSE标记的组织与cadherin-11共同染色（图2C），发现在正常的胰腺和PDA中，CFSE+细胞也是cadherin-11+；此外，与胰腺癌细胞标志物SOX9共同染色，发现CFSE+的细胞与SOX9+的癌细胞不同（图2C），进一步支持CFSE信号对间质细胞的特异性。

鉴于在胚胎发育过程中，间皮细胞可以分化为成纤维细胞和平滑肌细胞，所以作者用正常的间皮细胞（簇7）、apCAF（簇9）和其他密切相关的成纤维细胞群（集群1、4、8和10）进行伪时间分析，发现尽管正常的间皮细胞在成为apCAF时获得了成纤维细胞的特征并趋向于成纤维细胞，但它们对其他CAF群体的形成贡献有限（图2D），这支持iCAF和myCAF系来自常驻成纤维细胞。由于apCAFs通过下调间皮细胞基因和上调成纤维细胞基因获得了差异基因标签（图2E），所以对apCAFs中上调的基因进行通路和功能富集分析，以确定驱动这种基因特征变化的生物学过程，结果发现许多已识别的生物过程与损伤或炎症反应有关（图2F），这表明来自肿瘤小生境的创伤相关信号可以诱导apCAF的形成。

图2 间皮细胞在PDA形成过程中扩增并获得成纤维细胞特征

3、创伤相关肿瘤旁分泌信号诱导间皮细胞—apCAF转变

为验证间皮细胞—apCAF的转化，以及在PDA进展过程中确定间皮细胞的命运，利用一个由间皮细胞特异性基因Wt1启动子驱动的可诱导Cre-loxP系统构建Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato模型（图3A）。Wt1^CreERT2/+;R26^{LSL-tdTomato/+}小鼠在Wt1基因位点表达Cre-ERT2融合蛋白。CreERT2在他莫昔芬（TAM）处理后会从R26位点切除LSL序列，这将不可逆地诱导tdTomato表达。将TAM注射入Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato模型小鼠并收集胰腺（图3B）。结果显示正常胰腺间皮表达tdTomato（图3C-3D）。作为阴性对照，R26^LSL-tdTomato小鼠没有Wt1^CreERT2不表达tdTomato（图3E）。接下来，追踪PDA进展过程中间皮细胞的命运。将Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato小鼠胰腺内的间皮细胞标记为tdTomato+，原位注射源自KPfC小鼠的同基因PDA细胞系，在植入后3周收获成熟肿瘤（图3B），发现间皮细胞在PDA中大量扩增，tdTomato+细胞分布在肿瘤周围和内部（图3F-H）。此外，在正常胰腺中，间皮细胞不表达成纤维细胞标志物，如aSMA和IL-6（图3C-3D），而PDA内可见tdTomato+aSMA+（图3F）或tdTomato+IL-6+（图3G）细胞。间皮谱系追踪实验强有力的证明间皮细胞获得成纤维细胞特征，并有助于PDA的间质形成。

图3 PDA中间皮细胞的谱系示踪与可诱导转基因小鼠模型

4、间皮细胞系再现间皮细胞—apCAF转变

为研究肿瘤旁分泌信号是否能诱导间皮细胞分化为apCAFs，建立小鼠胰腺间皮细胞系。将间皮外植体接种到组织培养皿中，接种后5天，细胞开始从间皮迁移（图4A）。一旦融合，这些细胞进行流式细胞术，其中95%的细胞为podoplanin和MHC II双阳细胞（图4A），将这些细胞命名为胰腺间皮细胞（PanMeso）。对第10-20代PanMeso细胞进行转录组分析，发现其具有稳定的间皮基因标签和低表达的成纤维细胞基因（图4B）。用KPfC PDA类器官条件培养（CM）基处理PanMeso细胞，发现其显著降低间皮细胞基因的表达（图4C）。对差异上调的基因进行功能富集分析，发现其主要参与伤口和炎症响应（图4D），这与单细胞测序结果一致。进一步对肿瘤进行eGFP和aSMA或IL-6的IHC染色，发现TME诱导eGFP+ PanMeso细胞表达aSMA和IL-6（图4E和4F）。综上所述，使用PanMeso细胞的体外数据再现了间皮细胞的成纤维细胞转化，并强调了肿瘤旁分泌信号在促进这一过程中的重要性。

图4 PanMeso细胞中间皮细胞- apCAF转变的概述

5、apCAFs诱导幼稚CD4+ T细胞转变为Tregs细胞

采用图5A中的方案对KPfC肿瘤进行流式细胞术分选，对分选的细胞进行OVA处理，然后和CD4+ T细胞共培养。结果显示正常间皮细胞和apCAFs能以OVA依赖的方式诱导T细胞扩增早期激活标志物CD25和CD69的表达，而iCAFs和myCAFs则不能（图5B-C）。随后使用PanMeso细胞重复上述实验（图5A），PDA类器官CM诱导的apCAFs形成导致PanMeso细胞的抗原提呈能力增加（图5B-C）。

随后为探究apCAFs是否诱导Treg细胞形成，检测和OVA处理的apCAFs细胞共培养的CD4+ T细胞的Treg细胞的存在，结果显示apCAFs以抗原特异性的方式诱导Treg的形成（图5D-E）。进一步检测apCAFs诱导形成的Tregs细胞的免疫抑制功能，如图5F-G所示，其显著抑制CD8+ T细胞的增殖。综上所述，这些数据表明apCAFs可能是一个独特的免疫调节CAF群体，可以通过抗原依赖的TCR连接诱导Treg的形成和扩增。

图5 apCAFs诱导幼稚CD4 + T细胞进入Tregs

6、apCAFs存在于人类肿瘤中并与Tregs相关

为证明apCAFs与人类的相关性，收集人PDA肿瘤组织并进行多色免疫荧光观察apCAFs与Tregs。PDGFRa在除了间质细胞外的所有CAF类群中表达，所以PDGFRa⁺CD74⁺特异性标记apCAFs，PDGFRa⁺CD74^—标记其余类型CAFs（图6A）。结果显示，在人PDA中，apCAFs丰度具有异质性（图6B），并且与Tregs具有相关性，与其它CAF无相关性（图6C-D）。此外，作者使用上述小鼠apCAFs基因特征表征了两个人PDA和卵巢癌的单细胞数据集，发现两者间有重叠（图6F-G）。因此，以上表明在人肿瘤中也存在apCAFs并与Tregs相关。

图6 apCAFs存在于人类肿瘤中，并与Treg相关

7、IL-1和TGF-β参与间皮细胞—apCAF转化

为确定驱动间皮细胞向apCAF转化的信号通路，提取在apCAF中上调的差异基因，并对它们进行motif富集分析，鉴定到NF-kB通路的Nfkb1和Rela，TGF-β信号通路的Smad1，Smad3，Smad4（图7A）。IL-1诱导的NF-kB信号通路被预测负责iCAF谱系的形成，而TGFβ被预测驱动myCAF谱系。为验证这一结果，使用PDA类器官CM处理PanMeso细胞，结果显示NF-kB和TGF-β信号通路均被激活了（图7B）。随后检测IL-1和TGFβ是否驱动间皮细胞的apCAF表型，结果显示，与对照组比较，IL-1和TGFβ处理的PanMeso细胞中间质细胞基因的表达显著下降（图7C），相反成纤维细胞相关基因显著上调表达（图7D）。这些结果表明IL-1和TGFβ可以驱动间皮细胞向apCAF表型转化。

接下来探究IL-1和TGFβ是否影响间皮细胞的功能。结果显示OVA特异性TCR激活被IL-1和/或TGFβ预处理的PanMeso细胞增强（图7E-7F）。此外，IL-1和/或TGFβ预处理的PanMeso细胞显著增强Treg细胞数量（图7G-7H）。以上数据表明，IL-1/NF-kB和TGFb信号通路负责正常间皮细胞分化为apCAFs，并具有活化CD4+ T细胞和促进其分化为Treg的能力。

图7 IL-1和TGF-β参与间皮细胞—apCAF转化

8、靶向间皮素可抑制间皮细胞向apCADs转化

有两篇报道使用小鼠特异性阻断单克隆抗体（mAb）对抗间皮细胞标记物间皮素（MSLN Ab）来抑制间皮细胞向成纤维细胞的转变。因此，作者测试了mAb对间皮细胞apCAF形成的影响。使用PDA类器官CM、对照Ab、MSLN Ab处理PanMeso细胞，结果显示MSLN Ab显著抑制由PDA类器官CM引起的间质基因的下调和EMT及成纤维细胞基因的上调（图8A）。在小鼠体内，MSLN Ab显著减少TAM诱导的Wt1^CreERT2;R26^LSL-tdTomato小鼠的tdTomato阳性细胞（图8B-C）、tdTomato+aSMA/IL6+双阳性细胞（图8D-E）。

功能实验显示，MSLN Ab可抑制因PanMeso细胞的PDA类器官CM引起的抗原呈递和Treg细胞诱导能力（图8F-I）。重要的是，MSLN Ab可抑制肿瘤生长和肿瘤中Treg细胞比例（图8J-M）。综上所述，以上表明靶向MSLN可能是有效抑制间皮细胞向apCAF转化和克服apCAF诱导的免疫抑制的潜在策略。

图8靶向间皮素可抑制间皮细胞向apCADs转化

参考文献：

Huang H, Wang Z, Zhang Y, Pradhan RN, Ganguly D, Chandra R, Murimwa G, Wright S, Gu X, Maddipati R, Müller S, Turley SJ, Brekken RA. Mesothelial cell-derived antigen-presenting cancer-associated fibroblasts induce expansion of regulatory T cells in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2022 Jun 13;40(6):656-673.e7. doi: 10.1016/j.ccell.2022.04.011. Epub 2022 May 5. PMID: 35523176; PMCID: PMC9197998.