TGF-β信号通过circRNA CDR1as促进宫颈癌转移

实验方法：芯片测序，RNase R消化实验，RT-qPCR，Western blot，RNA 干扰，过表达，细胞迁移实验，伤痕愈合实验，荧光原位杂交、RNA pull-down，RIP以及建立宫颈癌体内模型。

宫颈癌的发病率和死亡率由于宫颈癌转移居高不下，转移的总体生存率仍然很低。因此，有效的预测性生物标志物对于缓解病情进展至关重要。在这里，作者首先通过TGF-β诱导宫颈癌细胞，发现CDR1as显著上调。接着通过CDR1as预测淋巴结转移和不良预后并且实验验证CDR1as能促进宫颈癌细胞的转移。为寻找与CDR1as相互作用的miRNA和蛋白，通过多种数据库进行生物信息学分析预测到IGF2BPs与CDR1as相互作用，并通过RIP和RNA pull-down实验验证，表明IGF2BP1可能是一个特定的潜在下游靶点。接着作者分析了CDR1as上调后不同mRNA和m6A水平的变化，结果表明TGF-β信号通过CDR1as和m6A在宫颈癌细胞中激活EMT。这些数据表明，TGF-β信号通过circRNA CDR1as促进宫颈癌转移。

技术路线：

主要实验结果：

1、TGF - β诱导宫颈癌细胞中CDR1as表达上调

EMT是肿瘤进展过程中早期的标志之一，其信号维持在很大程度上依赖于TGF- β的激活。用SRI-011381处理Siha细胞3天后，Siha细胞诱导EMT表型（图1A）。RNA测序显示6964个circRNA表达上调，6596个circRNA表达下调（图1B）。作者选择了50个变化最明显的环状RNA（circRNA）进行RT-PCR检测。结果显示，CDR1as的变化倍数最大（图1C）。因此，作者推测CDR1as参与TGF-β诱导的宫颈癌转移。

图1 TGF- β对宫颈癌细胞EMT的诱导作用

2、CDR1as与淋巴结转移不良预后相关

RNase R酶切实验显示，环状CDR1as只能在cDNA样品中扩增，而CDR1在gDNA和cDNA中均存在线型CDR1as（图2A）；RNase R消化后，环状结构的稳定性明显高于线状结构（图2B）。Sanger测序结果显示，扩增的寡核苷酸序列与circbase数据库中的序列相似（图2C）。这些结果表明CDR1as是一种环状RNA。FISH和核浆萃取实验显示CDR1as主要在细胞质中表达（图2D-E），这表明CDR1as可能在转录后起作用。采用原位杂交技术评估CDR1as与临床参数的关系（图2F，表2），结果显示CDR1as在淋巴结转移中表达较高（图2G），与总生存期较短、预后较差相关（图2K-L），但CDR1as与肿瘤分级、分期、原发肿瘤体积无显著关系（图2H-J）。

图2 CDR1as预测淋巴结转移和更差的总生存期

表2 CDR1as与临床病理因素

3、CDR1as促进宫颈癌细胞的转移

在三种癌细胞中过表达CDR1as后，qPCR结果显示，CDR1as成功转染到三种癌细胞中（图3A-C）；细胞迁移实验结果显示，与对照组比较，癌细胞的侵袭率和转移率分别增加了1.86倍和2.07倍，表明宫颈癌的转移显著加快（图3D-G）；细胞划痕实验结果显示，伤口愈合时间更短（图3H-I），这二者结果表明癌细胞的活性增强。作者还通过检测过表达CDR1as后细胞形态变化，以及RT-qPCR和Western blot检测E-CAD、N-CAD和SLUG等的表达情况（图3K-L）。这些结果表明CDR1as能促进宫颈癌的转移。

图3 CDR1as能促进宫颈癌细胞的转移

4、CDR1as通过与IGF2BP1结合促进宫颈癌细胞的EMT

CDR1as过表达后，细胞呈纺锤形形态，而转染载体的细胞上仍有明显的边缘，qPCR和Western blot结果显示，CDR1as的升高降低了E-cadherin的表达，增加了间充质标志物N-cadherin和Vimentin的表达（图3K-L），其中Slug的上调幅度最大。根据生物信息学分析，作者将几个数据库的搜索结果进行了重叠来鉴定CDR1as和miRNA之间的潜在结合，结果显示25个miRNA与CDR1as结合。其中，经生物信息学预测，miR-203能够调控Slug的表达。然而，CDR1as探针下拉实验没有发现Slug通路相关的miRNA（图4A），表明Slug的激活可能不受miRNA海绵的调节。除了竞争的内源性RNA （ceRNAs）外，有报道表明CDR1as能够影响蛋白质相互作用。例如CDR1as可以释放IGF2BP3的促转移功能。因此，作者进行了RNA-pull-down来鉴定可能与CDR1as结合的潜在蛋白质。实验结果显示在35kD-70kD之间有几个单独的条带（图4B）。通过生物信息学数据库检测到IGF2BPs与CDR1as相互作用。此外，在70 kD附近有条带，正好与IGF2BPs的分子量相吻合。作者进行了RIP和RNA pull-down实验，结果显示， CDR1as探针只能检测到IGF2BP1（图4C-D），表明IGF2BP1可能是一个特定的潜在下游靶点。为了探讨IGF2BP1是否影响过表达CDR1as细胞中的Slug表达，作者沉默了CDR1as过表达细胞中的IGF2BP1。结果表明，敲降IGF2BP1后Slug表达上调（图4E）。此外，RIP实验表明IGF2BP1优先结合Slug mRNA上的m6A修饰位点（图4F-H）。沉默IGF2BP1后也能通过CDR1as抑制肿瘤的转移和侵袭潜能（图4I）。综上所述，CDR1as与IGF2BP1特异性结合以稳定和提高Slug的表达。

图4 CDR1as通过与IGF2BP1结合促进宫颈癌细胞的EMT

5、TGF - β信号可能通过CDR1as和m6A在宫颈癌细胞中激活EMT

N6-甲基腺苷（m6A）几乎参与了RNA代谢的所有步骤，是转录修饰的重要组成部分。结合对CDR1as功能和机制的初步验证，作者分析了CDR1as上调后不同mRNA和m6A水平的变化。KEGG和GO分析表明，CDR1as显著激活了TGF-β信号（图5A）。此外，Western blot检测结果显示，过表达的CDR1as显著激活了p-smad2和p-smad3（图5B-C）。当用LY2109761处理过表达CDR1as的细胞后， EMT表型与过表达载体的相同，这表明CDR1as通过激活TGF-β信号传导促进EMT（图5D）。细胞迁移实验结果显示，与过表达的CDR1as细胞相比，用LY2109761处理过表达CDR1as的细胞组穿透细胞数量明显减少（图5E）。这些结果提示CDR1as激活TGF-β信号和EMT促进宫颈癌细胞转移。

图5 TGF - β信号通过CDR1as和m6A在宫颈癌细胞中激活EMT

6、CDR1as在体内促进宫颈癌细胞的进展

作者进行了体内实验，通过将宫颈癌细胞注射到小鼠皮下组织和足垫来评估CDR1as在宫颈癌转移中的体内作用。注射6周后，原发肿瘤的生长情况与对照组和CDR1as组有差异。裸鼠前腹皮下注射时，与对照组相比，肿瘤体积增大（图6A-B）， CDR1as过表达时，肿瘤体积增大，体重减轻（图6C-D）。足垫注射小鼠腹股沟，CDR1as组淋巴结明显肿胀（图6E）。最后，作者做了“TGF-β信号通过CDR1as促进宫颈癌转移”的通路图（图7）。

图6 CDR1as在体内促进宫颈癌细胞的进展

图7 “TGF-β信号通过CDR1as促进宫颈癌转移”信号通路

参考文献：

Zhong GL, Zhao Q, Chen ZL, Yao TT. TGF-β signaling promotes cervical cancer

metastasis via CDR1as. Molecular Cancer. 2023 March; 22(1):66. https://doi.org/10.1186/s12943-023-01743-9.