m6A阅读器YTHDF2促进多发性骨髓瘤细胞增殖

实验方法：RIP、MeRIP、RNA稳定性检测、免疫组化、ChIP。

多发性骨髓瘤(MM)是第二常见的血液恶性肿瘤。 m6A是最丰富的RNA修饰。YTHDF2识别含有m6A的RNA并加速降解以调节癌症进展。然而，YTHDF2在MM中的作用尚不清楚。我们研究了YTHDF2在MM中的表达水平和预后作用，并研究了YTHDF2对MM增殖和细胞周期的影响。结果显示，YTHDF2在MM中高表达，是MM生存的独立预后因素。沉默YTHDF2抑制细胞增殖，导致G1/S期细胞周期阻滞。RIP和MeRIP结果显示，YTHDF2以m6A依赖的方式加速了EGR1 mRNA的降解。此外，在体外和体内，YTHDF2的过表达通过依赖m6A的EGR1降解促进MM生长。此外，EGR1通过激活p21^cip1/waf1转录和抑制CDK2-cyclinE1来抑制细胞增殖和延缓细胞周期。EGR1敲低可逆转YTHDF2敲低后的增殖抑制和细胞周期阻滞。综上所述，YTHDF2的高表达通过EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-cyclin E1轴介导的细胞周期转变促进MM细胞增殖，突出了YTHDF2作为MM有效的预后生物标志物和有希望的治疗靶点的潜力。

技术路线

结果

1）YTHDF2在MM患者中高表达，且与预后相关

为了探讨YTHDF2表达与MM之间的关系，我们对MM的发展进行了全面分析。结果显示，YTHDF2在MM中的表达明显高于MGUS和SMM (图1A)。此外，YTHDF2在PCL中的表达高于MM (图1B)。此外，在MM患者中，较高的DSS、ISS和R-ISS分期与YTHDF2表达升高相关(图1C-E)。YTHDF2表达水平较高的MM患者的OS短于YTHDF2表达水平较低的患者(图1F)。我们进一步将YTHDF2表达与其他独立预后因素结合起来，并构建了一个Nomogram来计算总积分(图1G)。校准曲线显示，预测的1年、2年和3年生存概率与实际生存概率非常吻合(图1H)。总积分较高的MM患者的OS明显低于总积分较低的患者(图1I)。1年、2年和3年生存率的总积分的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.7858、0.7763和0.7629 (图1J)。接下来，我们检测了YTHDF2在MM细胞系和患者中的表达。研究结果显示，与正常质细胞相比，YTHDF2在MM细胞系和患者中的表达水平较高(图1K、L)。此外，在ISS和R-ISS越晚期的MM患者中，YTHDF2的表达水平也有所升高(图1M、N)。总之，这些结果表明，YTHDF2可能是预测MM预后的潜在生物标志物。

图1

2）沉默YTHDF2抑制MM细胞增殖，导致G1/S期细胞周期阻滞

为了进一步探讨YTHDF2在MM中的作用，我们使用特异性siRNA下调MM细胞系RPMI-8226和NCI-H929中YTHDF2的表达(图2A, B)。结果显示， YTHDF2的下调显著抑制了细胞活力(图2C、D)和细胞增殖(图2E、F)。细胞周期分析进一步揭示，RPMI-8226和NCI-H929中YTHDF2的下调导致G1期细胞增多，S期细胞减少，而G2期细胞无显著差异，提示可能存在G1/S期阻滞 (图2G、H)。

图2

3）YTHDF2以m6A依赖的方式增强EGR1 mRNA的降解

鉴于YTHDF2可以促进含有m6A转录本的降解，我们基于GSE47552数据集分析了MM患者相对于健康个体的显著下调基因。我们将这些下调基因与POSTAR3在线数据库中YTHDF2的PAR-CLIP-seq结果结合，最终获得388个基因(图3A)。接下来，使用在线metscape工具进行GO和途径富集分析，结果表明，YTHDF2与细胞周期的关系最为密切(图3B)。在这些与细胞周期相关的基因中，EGR1下调幅度最大，因此选择EGR1进行进一步验证。与正常质细胞相比，EGR1在MGUS、SMM和MM中的表达较低(图3C)。此外，在ISS分期较高的PCL和MM患者以及复发的MM患者中，EGR1的表达显著降低(图3D-F)。研究还表明，EGR1低表达的MM患者的OS明显较差(图3G)。此外，我们证实了与正常质细胞相比，MM细胞系中的EGR1下调(图3H)。此外，我们还研究了YTHDF2以m6A依赖的方式调节EGR1表达的能力。结果表明，YTHDF2的下调显著上调了EGR1的表达(图3I,3J)。RIP-qPCR验证了YTHDF2蛋白与EGR1 mRNA的相互作用(图3K)。在YTHDF2下调的MM细胞中，EGR1 mRNA的半衰期也显著延长，表明YTHDF2可以降低EGR1 mRNA的稳定性(图3L)。使用SRAMP发现了EGR1 mRNA的几个潜在m6A位点(图3M)，并进行MeRIP-qPCR。敲低YTHDF2显著增加MM细胞中EGR1 mRNA的m6A修饰(图3N)。综上所述，EGR1 mRNA是YTHDF2的直接靶点，YTHDF2可以在MM中以依赖m6A的方式加速EGR1 mRNA的降解。

图3

4）EGR1通过转录调控p21^cip1/waf1抑制细胞增殖，导致细胞周期阻滞

为了进一步验证EGR1在MM中的作用，我们在MM细胞系中沉默了EGR1(图4A, B)。EdU实验显示，沉默EGR1显著增强了细胞增殖(图4C, D)。此外，细胞周期分析显示，EGR1的下调导致S期细胞增加，G1期细胞减少，提示G1/S期的促进(图4E, F)。CDKN1A，也被命名为p21^cip1/waf1，是一种被充分研究的肿瘤抑制因子，以介导细胞周期阻滞而闻名。EGR1的敲低显著降低了p21^cip1/waf1的表达(图4A, B)。为了进一步评估EGR1是否参与了MM细胞中p21^cip1/waf1的转录激活，我们使用JASPAR预测了p21^cip1/waf1启动子上潜在的EGR1结合基序(图4G)。ChIP-qPCR检测证实了EGR1与p21^cip1/waf1启动子之间的相互作用(图4H, I)。此外，我们构建了野生型(wt)或突变型(mut)序列的荧光素酶报告质粒，发现在EGR1敲低和YTHDF2过表达时，wt荧光素酶报告质粒中的荧光素酶活性均显著降低(图4J)。总的来说，EGR1可以通过转录激活p21^cip1/waf1来抑制MM细胞的增殖并延缓细胞周期。

图4

5）沉默YTHDF2通过EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1轴抑制细胞增殖和细胞周期

先前的研究表明，CDK2-Cyclin E1参与了p21^cip1/waf1介导的G1/S细胞周期转变。因此，我们推测YTHDF2可以通过MM中的EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1轴调控细胞增殖和细胞周期。正如预期的那样，在MM细胞系中，YTHDF2敲低后，p21^cip1/waf1表达增加，而CDK2和Cyclin E1表达减少(图5A)。相反，EGR1的敲低导致p21^cip1/waf1的下调，但导致CDK2和cyclin E1的上调(图5B)。为了进一步研究YTHDF2/EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2Cyclin E1轴在MM中的作用，我们在MM细胞系中同时沉默YTHDF2和EGR1。EGR1的敲低不仅逆转了YTHDF2沉默导致的EGR1和p21^cip1/waf1表达的增加，还逆转了CDK2和Cyclin E1表达的降低(图5C-E)。此外，细胞周期分析显示，EGR1敲低显著逆转了YTHDF2敲低诱导的G1/S期阻滞(图5F、G)。EdU实验显示，沉默EGR1显著增强了YTHDF2敲低MM细胞的细胞增殖(图5H、I)。总体而言，YTHDF2可以通过EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1轴促进MM细胞增殖和G1/S期过渡。

图5

6）敲低YTHDF2抑制MM异种移植模型中的肿瘤生长

为了评估YTHDF2对MM在体内增殖的影响，我们将转染shNC或shYTHDF2的RPMI-8226细胞皮下注射到裸鼠体内。shYTHDF2转染的RPMI-8226细胞的肿瘤比shNC转染的RPMI-8226细胞的肿瘤在外观上更小(图6A, B)。YTHDF2的敲低显著降低了肿瘤体积(图C)和肿瘤重量(图6D)。IHC结果证实，在YTHDF2下调的异种移植物中，YTHDF2、CDK2、Cyclin E1和Ki-67的表达降低，EGR1和p21^cip1/waf1的表达增加(图6E, F)。综上所述，这些数据证实了YTHDF2在体内通过EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1轴促进MM增殖的致癌作用。

图6

7）过表达YTHDF2可促进MM在体内和体外的生长

研究结果进一步表明，通过慢病毒转导过表达YTHDF2 (LV-oeYTHDF2)可显著降低EGR1和p21的表达，但增强CDK2和Cyclin E1的表达(图7A, B)。此外，YTHDF2的上调可显著促进细胞增殖和细胞周期的进展(图7C-F)。过表达YTHDF2的MM细胞中EGR1 mRNA的半衰期显著缩短(图7G)。MeRIP-qPCR也显示，过表达YTHDF2显著降低了EGR1 mRNA的m6A修饰(图7H)。此外，我们将转染LV-NC和LV-oeYTHDF2的RPMI-8226细胞皮下注射到裸鼠体内，观察到LV-oeYTHDF2组的肿瘤比LV-NC组大(图7I)。此外，YTHDF2的过表达显著增加肿瘤体积(图7J)和肿瘤重量(图7K)。免疫组化结果证实，与LV-NC组相比，LV-oeYTHDF2异种移植物中EGR1和p21^cip1/waf1的表达降低，YTHDF2、CDK2、Cyclin E1和Ki-67的表达增加 (图7L, M)。

图7

结论：YTHDF2在MM中是一个独立的预后因子，可以通过EGR1/p21^cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1轴促进肿瘤生长和细胞周期转变，突出表明YTHDF2可以作为预测MM预后的潜在生物标志物和有希望的治疗靶点。

参考文献：Liu R, Miao J, Jia Y, Kong G, Hong F, Li F, Zhai M, Zhang R, Liu J, Xu X, Wang T, Liu H, Hu J, Yang Y, He A. N6-methyladenosine reader YTHDF2 promotes multiple myeloma cell proliferation through EGR1/p21cip1/waf1/CDK2-Cyclin E1 axis-mediated cell cycle transition. Oncogene. 2023 Apr 3. doi: 10.1038/s41388-023-02675-w.