LINC00240通过USP10介导的DDX21稳定促进胃癌进展

实验方法：RT‑qPCR，细胞增殖和集落形成分析，异种移植研究，伤口愈合，transwell，RNA pulldown，RNA‑IP，Western blot，泛素化分析。

       胃癌仍然是世界上癌症死亡的主要原因。从全基因组关联研究鉴定的胃癌风险位点转录的lncRNAs是癌症发生和疾病进展的关键模式。然而，lncRNA在大多数癌症风险位点的生物学意义仍然知之甚少。在本研究中，我们发现了来自6p22.1胃癌风险位点的LINC00240，它是一种新的致癌基因。胃癌标本中LINC00240的表达明显高于正常组织，其高表达水平与患者生存率差相关。LINC00240在体外和体内均能促进胃癌细胞的恶性增殖、迁移和转移。重要的是，LINC00240可以通过其新型去泛素化酶USP10消除癌蛋白DDX21的泛素化，稳定DDX21，从而促进胃癌的进展。综上所述，我们的数据揭示了lncRNAs如何通过加强靶蛋白与其去泛素酶之间的相互作用来控制蛋白去泛素化的新范例。这些发现突出了lncRNA作为创新治疗靶点的潜力，从而为临床转化奠定了基础。本文于2023年4月发表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技术路线

结果：
1）胃癌组织中LINC00240表达升高与患者生存时间缩短相关
       为了检验染色体6p22.1风险位点转录的lncRNA是否促进胃癌的发展，我们首先在Discovery队列配对的胃癌标本和正常组织中测定了三种候选lncRNA (LINC00240、LINC01012和ZNRD1AS1)的水平(图1A)。我们发现只有LINC00240在恶性组织中较正常胃标本表达明显升高(图1A)。我们发现验证队列胃癌标本中LINC00240水平显著升高(图1B)。为了支持这一观点，与中国另一个胃癌队列(GSE54129)的正常组织相比，癌标本中LINC00240表达显著升高。与早期疾病患者相比，晚期疾病患者中LINC00240的表达显著升高(图1D和E)。重要的是，LINC00240水平与无进展生存期(PFS)和患者的总生存期(OS) 显著相关(图1F和G)。与LINC00240高表达的患者相比，LINC00240低表达的患者PFS或OS时间延长(图1F和G)，提示LINC00240可能作为一种新型癌基因参与了胃癌的进展。

2）LINC00240在体外和体内对胃癌细胞的恶性增殖有促进作用
       接下来，我们在体外和体内研究了LINC00240在胃癌发展中的作用。在稳定表达LINC00240 shRNAs的HGC-27和MGC80-3细胞中，lncRNA的表达显著降低 (图2A)。在稳定表达LINC00240结构的HGC-27和MGC80-3细胞中，发现LINC00240显著过表达 (图2B)。如图2C和2D所示，沉默LINC00240可显著抑制HGC-27和MGC80-3细胞的增殖；而异位表达LINC00240可显著提高胃癌细胞活力。同样，下调LINC00240的表达抑制了HGC-27和MGC80-3细胞的克隆形成 (图2E)。过表达LINC00240的胃癌细胞克隆原性增强(图2F)。此外，沉默LINC00240可显著促进胃癌细胞凋亡(图2G)。总之，这些数据阐明了LINC00240在胃癌中的致癌功能。然后，我们通过胃癌异种移植评估了LINC00240在体内的作用。与对照组相比，稳定沉默LINC00240明显抑制胃癌异种移植物的生长(图2H-J)。相反，稳定过表达LINC00240的异种移植物生长速度更快，肿瘤体积和肿瘤重量明显高于对照异种移植物 (图2K-M)。综上所述，这些结果表明LINC00240在体内能够促进胃癌的恶性增殖。

3）LINC00240提高胃癌细胞侵袭活性
       接下来，我们研究了LINC00240是否会影响胃癌细胞的迁移和侵袭。我们进行了伤口愈合实验，以确定LINC00240对胃癌细胞迁移的影响。稳定的LINC00240-KD显著损害胃癌HGC-27细胞的运动能力，而稳定的LINC00240-OE则加速胃癌HGC-27细胞的迁移能力。与此观察结果一致，沉默LINC00240明显减弱了胃癌MGC80-3细胞的迁移，强制表达的LINC00240促进了MGC80-3细胞的运动能力(图3A)。侵袭实验表明，稳定沉默的LINC00240可以减少胃癌细胞的侵袭。相反，异位表达LINC00240后，胃癌细胞的侵袭能力增强(图3B)。然后，我们在体内研究了LINC00240是否可以调节胃癌细胞的转移。我们发现，LINC00240缺失抑制胃癌细胞的肺转移；而稳定过表达的LINC00240明显促进了胃癌肺转移(图3C)。HE染色和vimentin免疫组化进一步证实了LINC00240在体内对胃癌细胞转移的影响(图3D和E)，这些结果表明LINC00240增强了胃癌细胞的迁移和侵袭能力。

4）LINC00240在胃癌细胞中与癌蛋白DDX21相互作用
       为了探究LINC00240在胃肿瘤发生中的作用，我们首先检测了LINC00240在胃癌细胞中的细胞定位。有趣的是，我们发现LINC00240主要位于胃癌细胞的细胞核中(图4A)。为了测试LINC00240是否与胃癌中的某些蛋白质相互作用，我们对由LINC00240拉下的MGC80-3细胞提取物进行了RNA拉下试验和质谱蛋白质组学。在LINC00240下拉的蛋白中，我们通过独立的RNA下拉和WB成功验证了DDX21是lncRNA的结合蛋白(图4B)。RIP实验表明，与IgG对照相比，两种胃癌细胞系中抗DDX21抗体沉淀的RNA-蛋白复合物中LINC00240明显富集 (图4C)。为了探索LINC00240与DDX21相互作用所需的特定区域或结构域，我们构建了各种截断的DDX21构建体和截断的LINC00240质粒(图4D和E)。结果表明，DDX21蛋白的GUCT基序(aa 617-709)和LINC00240 RNA的中间区域(核苷酸357-674)是LINC00240与蛋白质相互作用需要的(图4D和E)。与正常组织相比，胃癌组织中DDX21的表达也显著升高 (图4F)。DDX21的异常高表达与胃癌患者的OS或PFS差相关 (图4G和H)。沉默DDX21可显著抑制HGC-27或MGC80-3细胞的活力(图4I-K)，表明DDX21在胃癌中的致癌性质。综上所述，这些发现表明，在胃癌细胞中，LINC00240可以通过GUCT基序与癌蛋白DDX21相互作用。

5）LINC00240通过泛素-蛋白酶体途径抑制DDX21的降解
       有趣的是，沉默LINC00240明显抑制了DDX21蛋白在胃癌细胞中的表达(图5A)。相反，过表达的LINC00240在HGC27或MGC80-3细胞中显著上调DDX21蛋白水平(图5B)。与对照组相比，用MG132处理稳定的LINC00240-KD胃癌细胞增加了内源性DDX21蛋白的表达(图5C和D)。MG132消除了LINC00240诱导的HGC-27或MGC80-3细胞中DDX21蛋白的上调(图5E和F)，表明lncRNA可能参与调节DDX21的蛋白酶体降解。为了验证这一点，我们接下来用蛋白质合成抑制剂CHX处理了HGC-27或MGC80-3细胞，检测了DDX21的表达。结果发现，稳定的LINC00240-KD细胞中DDX21蛋白水平的下降速度远快于对照细胞(图5G)。相反，用CHX处理稳定的LINC00240-OE胃癌细胞导致DDX21蛋白的半衰期明显长于对照细胞(图5H)。我们随后探索了依赖LINC00240的DDX21的降解是否通过其泛素化介导。与对照细胞相比，在稳定的LINC00240-KD细胞中检测到DDX21蛋白的泛素信号显著增加(图5I)。与对照细胞相比，稳定的LINC00240-OE细胞中DDX21的泛素化明显降低(图5I)。拯救实验表明，沉默DDX21可显著抑制稳定过表达LINC00240的胃癌细胞的增殖(图5J)。相反，过表达DDX21可增强稳定敲低LINC00240的胃癌细胞的增殖(图5K)。这些结果表明LINC00240通过泛素-蛋白酶体系统稳定DDX21蛋白。

6）LINC00240阻断DDX21与其新型去泛素酶USP10的结合
       为了揭示LINC00240如何延缓DDX21的泛素蛋白酶体降解，我们分析了MGC80-3细胞中LINC00240下拉的蛋白。质谱分析结果表明，该样品中只有一种去泛素酶USP10。为了确认USP10是否是DDX21的一种新型去泛素酶，我们首先检测了USP10沉默表达的HGC-27或MGC80-3细胞中DDX21的水平(图A)。在敲除USP10表达后，与对照细胞相比，胃癌细胞中DDX21蛋白水平明显降低(图6A)。Co-IP实验显示，内源性USP10可以在HGC-27或MGC80-3细胞中被DDX21沉淀(图6B)。在两种胃癌细胞系中，内源性DDX21也可以被USP10沉淀(图6C)。接下来，我们研究了LINC00240是否影响细胞中DDX21和USP10之间的相互作用。与对照细胞相比，稳定的LINC00240-KD细胞中DDX21沉淀的USP10蛋白较少(图6D和E)，而稳定的LINC00240-OE细胞中DDX21沉淀的USP10蛋白较多(图6D和G)。综上所述，这些发现表明，LINC00240通过增强DDX21与其新型去泛素酶USP10的相互作用来促进DDX21的稳定(图6H)。

结论：我们揭示了从6p22.1位点转录的LINC00240在胃癌中的重要性，并发现了LINC00240和USP10之间在控制致癌蛋白DDX21泛素化中的一种新的调控伙伴关系。LINC00240-USP10-DDX21轴可能成为临床上胃癌的潜在治疗靶点。
参考文献：Zhang N, Wang B, Ma C, Zeng J, Wang T, Han L, Yang M. LINC00240 in the 6p22.1 risk locus promotes gastric cancer progression through USP10-mediated DDX21 stabilization. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Apr 18;42(1):89. doi: 10.1186/s13046-023-02654-9.