新的铁死亡增敏剂——地塞米松
地塞米松（Dexamethasone）被广泛用于免疫抑制治疗。本研究证明地塞米松对铁死亡敏感，铁死亡是一种铁催化的坏死形式，以前被认为是导致急性肾损伤、心肌梗死和中风等疾病的原因，所有这些疾病都是由谷胱甘肽（GSH）耗竭引发的。本研究数据表明，地塞米松对铁死亡的增敏是通过GR介导的DPEP1表达增加和GSH耗竭，具有临床和治疗意义。本研究于2022年2月发表在《Science Advances》IF 14.97期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、地塞米松对erastin诱导的铁死亡敏感但对RSL3诱导的铁死亡不敏感
作者通过5μM的erastin抑制system Xc-来诱导铁死亡。通过流式细胞仪，检测到在最初的30小时内，与只用erastin处理的组相比，erastin+地塞米松处理组的Annexin V/7AAD双阴性细胞（活细胞）明显减少，而Annexin V/7AAD双阳性细胞的百分比明显增加（图1A和B）。为直接评估地塞米松对铁死亡的影响，构建了一个3D打印的孵化室，它包含由玻璃片分隔的一个孔的两个侧面。该室允许我们在用对照或1μM地塞米松预孵化后30小时的整个观察期内用一台相机进行时间推移成像。将SYTOX绿和Annexin V添加到室的两侧，并用5μM的erastin刺激细胞。在地塞米松处理的细胞中检测到SYTOX绿更早、更明显的阳性反应（图1C）。经过量化，在5μM erastin+1μM地塞米松处理后30小时，多达85%的细胞表现出SYTOX阳性信号，而在erastin刺激的对照组中大约只有40%的细胞是阳性的（图1C）。总之，这些数据表明，1μM地塞米松能使HT1080细胞对erastin诱导的铁死亡敏感。
接下来用小分子RSL3诱导铁死亡，RSL3是谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的一种特征明确的抑制剂。与erastin诱导铁死亡相反，RSL3诱导铁死亡后，地塞米松预处理并没有改变Annexin V/7AAD阴性细胞的百分比（图1D）。erastin和RSL3诱导的铁死亡之间的差异表明，地塞米松诱导的铁死亡加速仅限于铁死亡途径的GSH调节部分。总之，这些数据表明，地塞米松不影响RSL3诱导的铁死亡。
图1 地塞米松对erastin诱导的铁死亡敏感，但对RSL3诱导的铁死亡不敏感
2、糖皮质激素，而不是醛固酮或脱氢表雄酮，对erastin诱导的铁死亡敏感
鉴于类固醇激素之间的潜在冗余性，接下来询问其他类固醇激素是否可能复制地塞米松对铁死亡的影响。虽然地塞米松表现出最强的效果，但泼尼松龙和醛固酮（如果有的话，也只是非常小的程度）也在该试验中表现出敏化作用，而与脱氢表雄酮（DHEA）共存则没有效果（图2A）。众所周知，用糖皮质激素处理会导致GR受体下调，作者在用地塞米松和泼尼松龙刺激后的铁死亡敏感细胞中证实了这种效应。相反，醛固酮和DHEA并没有导致类似的GR的明显下调。作为额外的对照，作者调查了矿物皮质激素受体（MR）的表达水平，已知它被醛固酮下调，发现地塞米松和泼尼松龙也下调了MR（图2B）。总之，这些数据表明，地塞米松诱导的对铁死亡的敏感性可能是通过GR介导的。
3、地塞米松诱导的对铁死亡的致敏需要GR
地塞米松和其他糖皮质激素被描述为通过GR转录或以GR独立的方式控制细胞过程。为测试GR在本系统中的作用，作者用Cas9稳定地转染了HT1080细胞，并添加了引导RNA以产生HT1080 crKO（CRISPR敲除）的GR（图2C）。与对照组细胞相比，GR的缺失完全逆转了地塞米松或泼尼松龙介导的对erastin诱导的铁死亡的敏感性（图2D）。这些结果表明，糖皮质激素诱导的对erastin诱导的铁死亡的敏感化需要GR。
图2 类固醇诱导的对erastin诱导的铁死亡的致敏需要GR
4、地塞米松处理降低HT1080细胞的GSH
为了解地塞米松对GR的刺激是如何影响erastin诱导的而不是RSL3诱导的铁死亡，首先观察了铁死亡途径的已知标志物的蛋白表达水平。如图3A所示，在地塞米松刺激后，检测到ACSL4、SLC7A11、GPX4、TXNRD1、PRX1、TRX、CBS或CSE的表达没有明显变化。此外，检测了HMOX1、GCLC和GCLM的蛋白表达水平（图3B）。如预期的，HOMX1被erastin上调，而GCLC被地塞米松上调。为进一步了解细胞的氧化还原状态，使用LC-ESI-QToF质谱来准确评估用1μM地塞米松处理后GSH的水平。如图3C所示，作为GSH耗竭的对照，加入了erastin，虽然erastein完全耗尽了GSH，但地塞米松导致GSH含量减少50%以上，而没有大量的细胞发生实际的铁死亡（质膜破裂）。这个实验解释了为什么用地塞米松预处理能使erastin诱导的铁死亡敏感，而RSL3诱导的铁死亡没有改变，因为后者绕过了铁死亡诱导时对GSH耗竭的需要。
为确定GR激活下游的铁死亡敏感性的潜在未知调节因子，进行RNA-seq。在最显著的上调和下调的基因中，出现了几个与氧化还原平衡有关的基因，如图3D所示。在排名靠前的上调蛋白中，作者决定进一步验证DPEP1。
图3 对亲代HT1080和GR-crKO细胞进行无偏倚的RNA测序，发现地塞米松诱导的基因与铁死亡有关
5、敲低DPEP1逆转地塞米松赋予的对erastin诱导的铁死亡的敏感性
用1 μM地塞米松处理12小时后，DPEP1在蛋白水平上调（图4A）。在Transwells培养的人原生肾小管上皮细胞中，DPEP1标记的免疫荧光在地塞米松处理后表现出增加，同时保持顶端表达/极性（图4B）。总之，这些结果证实，地塞米松确实能上调DPEP1的蛋白表达。为测试DPEP1的功能作用，在HT1080细胞中敲除DPEP1（图4C）。如图4D所示，DPEP1的敲除逆转了地塞米松对erastin诱导的铁死亡的敏感性。
图4 地塞米松介导的对erastin诱导的铁死亡的致敏是由DPEP1介导的
6、地塞米松加速新分离的小鼠肾小管的LDH的自发释放
文献表明在新鲜分离的肾小管中，铁死亡驱动自发的急性肾小管坏死。作者用这个体外模型来评估地塞米松对肾小管乳酸脱氢酶（LDH）释放的影响。与对照处理的肾小管相比，地塞米松共处理导致LDH的释放明显增加，这种影响被Fer-1（图5A和B）逆转。地塞米松不能加速从DPEP1缺陷小鼠的小管中释放LDH（图5C和D）。与DPEP1在地塞米松诱导的敏化过程中的作用相一致，地塞米松/西司他丁共处理的肾小管与对照处理的肾小管相比，没有表现出更高的LDH释放水平（图5E和F）。总之，这些数据表明，地塞米松在GR和DPEP1的介导下具有促进肾脏收缩的作用。
图5 在野生型小鼠中，地塞米松加速新分离肾小管的铁死亡，而在DPEP1基因敲除小鼠中则没有
实验方法：细胞培养和转染，WB，流式细胞术，LDH释放实验，LC-ESI-QtoF质谱，免疫荧光，3D打印双腔室同时活细胞成像，实时成像技术，RNA测序，小鼠模型和药物处理，小鼠胸腺细胞和原代肾小管的分离。
参考文献：
von Mässenhausen A, Zamora Gonzalez N, Maremonti F, Belavgeni A, Tonnus W, Meyer C, Beer K, Hannani MT, Lau A, Peitzsch M, Hoppenz P, Locke S, Chavakis T, Kramann R, Muruve DA, Hugo C, Bornstein SR, Linkermann A. Dexamethasone sensitizes to ferroptosis by glucocorticoid receptor-induced dipeptidase-1 expression and glutathione depletion. Sci Adv. 2022 Feb 4;8(5):eabl8920. doi: 10.1126/sciadv.abl8920. Epub 2022 Feb 2. PMID: 35108055; PMCID: PMC8809683.