巨噬细胞转录因子TonEBP通过损伤诱导的信号通路促进系统性红斑狼疮和肾损伤

       系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种自身免疫性疾病，其特征是自身反应性B细胞和包括髓系细胞在内的许多其他类型免疫细胞的失调。狼疮性肾炎（LN）是SLE常见的靶器官表现。强直反应增强结合蛋白（TonEBP又称T淋巴细胞核因子5（NFAT5）），最初被鉴定为细胞对高渗应激反应的中心调节因子，是一种多效应激蛋白，参与多种免疫代谢疾病。为探讨TonEBP的作用，研究检测了LN患者肾活检样本。与对照组相比，TonEBP在患者肾脏细胞和浸润的免疫细胞中表达升高。肾脏TonEBP mRNA在LN中升高，并与编码炎症细胞因子的mRNA和蛋白尿程度相关。在降植烷诱导的小鼠SLE模型中，髓系TonEBP缺陷阻断了SLE和LN的发展。在巨噬细胞中，响应损伤相关分子模式的各种Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）通过刺激其启动子诱导TonEBP表达。TLRs下游的细胞内信号依赖于TonEBP。因此，TonEBP可以作为NF-kB的转录辅助因子，通过蛋白-蛋白相互作用激活mTOR-IRF3/7。此外，TonEBP缺陷的巨噬细胞表现出更高的胞葬作用，TonEBP髓系缺陷的动物表现出Th1和Th17分化减少，与TLR信号缺陷的巨噬细胞一致。因此，本研究数据表明髓系TonEBP可能是SLE和LN有吸引力的治疗靶点。研究于2023年4月发表于期刊《Kidney International》上，IF：18.998。

技术路线：

主要研究结果：
1、LN患者的临床特征
       作者首先根据临床数据判断SLE和LN患者的特征。尽管所有患者均出现血尿，但LN组的蛋白尿水平高于对照组，血清补体水平低于对照组（表1）。表2展示了LN患者的临床特征。

2、LN患者肾脏中促炎细胞因子的表达上调，并与TonEBP mRNA表达相关
       由于TonEBP的表达上调驱动促炎细胞因子的转录，是类风湿关节炎和肝炎中炎症组织的关键特征，作者首先分析冷冻肾活检样本中TonEBP编码的mRNA表达和细胞因子。LN组TonEBP mRNA表达高于对照组（图1a）。LN组中IL6、IL1B、MCP1、TNFA和IFNB mRNA的表达也显著升高。此外，MCP1、IFNA和IFNB mRNA的表达与TonEBP mRNA的表达具有相关性（图1b），这与TonEBP在促炎细胞因子转录中的作用一致。

图1 LN患者肾中TonEBP和促炎因子mRNA的表达

3、LN患者肾TonEBP升高
       接下来，作者进行了肾脏TonEBP的免疫组化检测。TonEBP在细胞核和细胞质中均有明显表达（图2a）。在LN患者肾小球中，TonEBP定位于多种细胞类型，包括足细胞、壁上皮细胞、内皮细胞和中性粒细胞。LN组肾间质区域大量免疫细胞浸润。在肾小管中，TonEBP在尿调蛋白染色阳性的远端小管和尿调蛋白染色阴性的集合管中表达明显，而在近端小管中表达较弱（图2a）。LN组肾各部位（肾小球、间质和肾小管区）TonEBP阳性细胞的数量明显高于对照组（图2b）。因此，TonEBP的肾蛋白表达在LN中明显升高，与其mRNA水平一致。
       接下来，作者利用多重免疫荧光染色将TonEBP表达定位到各种肾脏和免疫细胞。LN组中TonEBP阳性细胞数明显升高（图3）。在上皮和内皮（CD31⁺）细胞中观察到增加。免疫细胞（图3）：CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、CD68⁺巨噬细胞、TonEBP⁺ CD86⁺ M1巨噬细胞也是如此。然而，作者无法充分评估肾脏TonEBP⁺ CD206⁺ B细胞、TonEBP⁺ CD11⁺树突状细胞和TonEBP⁺ CD206⁺ M2巨噬细胞，因为这些细胞数量太少。综上所述，在LN中，TonEBP在肾脏细胞和浸润的免疫细胞中表达升高，包括CD4⁺ T细胞和巨噬细胞。

图2 LN患者TonEBP的肾脏分布

图3 多重免疫荧光染色肾活检组织内皮细胞、上皮细胞和浸润性免疫细胞中TonEBP的表达

4、TonEBP单倍体缺陷预防前列腺素诱导的狼疮
       接下来，作者询问是什么触发了TonEBP的肾脏表达。为响应这个问题，作者使用了单次注射降植烷诱导的SLE小鼠模型（图4a）。作者随后比较TonEBP单倍型缺陷（TonEBP^+/D）小鼠和野生型（TonEBP^+/+）小鼠，因为单倍型缺陷动物对实验性诱导的类风湿性关节炎和糖尿病肾病具有抵抗力。野生型小鼠表现出明显的SLE/LN表型，包括脾肿大、循环抗dsDNA自身抗体水平升高、血清补体成分3水平降低、肾脏肥大和肾小球损伤，并伴有肾小球IgG和补体成分3沉积（图4b-h）。此外，与LN患者相似，肾组织中TonEBP的表达明显升高。更重要的是，这种表型在TonEBP单倍体缺陷动物中缺失，表明TonEBP可能参与SLE的发生和相关肾损伤。

图4 TonEBP单倍体缺陷预防SLE和肾损伤的发展

5、髓系TonEBP是前列腺素诱导狼疮发展所必需的
       髓样TonEBP是类风湿关节炎中树突状细胞成熟和巨噬细胞活化所必需的。鉴于作者在LN患者巨噬细胞中观察到TonEBP升高（图3），作者利用髓系特异性敲除小鼠TonEBP（TonEBP^fl/fl , LysM-cre）及其同窝的TonEBP^fl/fl探索髓系TonEBP的作用（图5a）。作者发现TonEBP髓系特异性缺失的小鼠与TonEBP单倍型缺失的小鼠相似，均未发生SLE和LN（图5b-h）。在髓系TonEBP缺陷小鼠中，肾脏TonEBP表达增加也被减弱（图5h）。

图5 髓系TonEBP缺乏可减轻SLE和肾损伤的严重程度

6、髓系TonEBP是前列腺素诱导狼疮中髓系细胞扩张和激活所必需的
       接下来，作者询问髓系细胞TonEBP缺失是否影响脾脏中免疫细胞群。虽然TonEBP^fl/fl动物的巨噬细胞（CD11b⁺ F4^/80⁺细胞）或中性粒细胞（CD11⁺-6G⁺细胞）数量显著增加，但在TonEBP^fl/fl, Lys M-cre同窝动物中没有观察到增加（图6a-b）。
       MHCⅡ和共刺激分子（CD80和CD86）的表面表达对于抗原呈递细胞诱导的抗原呈递和T细胞分化非常重要。降植烷处理后，TonEBP^fl/fl小鼠脾脏CD11b ⁺细胞群表面CD86和MHCII表达升高，而TonEBP^fl/fl，LysM-cre小鼠脾脏CD11b ⁺细胞群表面CD86和MHCII表达降低（图6c）。

图6 髓系TonEBP缺乏可阻断巨噬细胞和嗜中性粒细胞的扩张，以及T -辅助细胞1（Th1）和T -辅助细胞17（Th17）细胞的分化

7、髓系TonEBP是前列腺素诱导狼疮中Th1和Th17细胞反应所必需的
       抗原递呈细胞将抗原递呈给T细胞，激活并触发初始T细胞的分化，是SLE发病机制中的关键事件。由于髓系TonEBP对于抗原呈递细胞的扩增和抗原呈递相关分子的表达是必需的，因此作者询问髓系TonEBP是否有助于T细胞分化。首先，作者分析了降植烷处理后4个月的全脾淋巴细胞亚群。尽管TonEBP缺失降低了CD19⁺ B220⁺细胞的比例，但CD4⁺和CD8⁺ T细胞群的比例并未受到影响。作者进一步分析CD4⁺ T细胞发现，髓系特异性TonEBP缺陷小鼠中辅助性Th1和Th17细胞和调节性T细胞数量无变化（图6d）。

8、TonEBP通过NF-kB和mTOR-IRF3/7磷酸化介导TLR介导的巨噬细胞活化
       为了解TonEBP在髓系细胞中的作用，作者决定研究巨噬细胞。作者使用从雌性TonEBP^fl/fl、Lys Mcre小鼠及其同窝TonEBP^fl/fl小鼠分离的腹腔巨噬细胞（PMs）。作者发现，这些配体以TonEBP依赖的方式诱导与Th1^/Th17分化相关的促炎细胞因子和I型IFNs的表达（图7a）。TonEBP依赖的CD80、CD86和MHCⅡ基因和蛋白的诱导模式相同（图7b，图8）。这些变化与TonEBP表达升高有关（图7a）。
       此外，作者试图揭示TonEBP发挥作用的分子机制。首先，作者想知道TonEBP的诱导是否与TonEBP启动子的激活有关。为解决这个问题，作者构建了一个包含z5-kb人TonEBP启动子序列的pGL3荧光素酶报告载体。LPS、R848和CpG-B刺激RAW264.7细胞中TonEBP启动子驱动的荧光素酶表达> 5倍（图9a）。这些数据表明TLRs的参与通过启动子驱动TonEBP的表达。
       接下来，作者检测了来自TonEBP^D /D小鼠的胚胎成纤维细胞，其中TonEBPD等位基因的基因产物不能刺激NF-kB，因为它不与p65相互作用。在这些细胞中，NF-kB响应TLR配体的激活被阻断（图9b），TonEBP-p65相互作用缺失（图9c）。总之，这些数据表明TonEBP通过与p65的蛋白质相互作用来刺激NF-kB响应TLR配体。
       作者还检测了TLR配体刺激RAW264.7细胞中IRF3和IRF7的表达，IRF3和IRF7调控的I型IFN-Ifnb1的mRNA表达被TLR配体以TonEBP依赖的方式刺激。IRF3的磷酸化可被LPS和R848刺激，而IRF7的磷酸化可被R848和CpG-B刺激，并呈TonEBP依赖性（图9d-e）。

图7 TonEBP调节巨噬细胞中TLRs介导的免疫反应和抗原递呈相关基因

图8 TonEBP促进巨噬细胞参与TLRs介导的激活和抗原递呈的分子表达

图9 TonEBP介导NF-kB转录活性和IRF3/7响应TLRs配体的磷酸化。

9、TonEBP阻断巨噬细胞的胞葬
       鉴于凋亡细胞清除在SLE发病机制中的重要性，作者检测了TonEBP在PMs胞葬作用中的作用。首先，作者评估了负责胞葬作用的桥接分子（Gas6和CD36）和调节吞噬作用受体（Nr1h3和Ppard）的转录因子的表达。TonEBP缺失的PMs在TLR配体的反应中显示出与这些转录因子和桥接分子相关的基因的高表达（图10a）。接下来，作者检测了PMs对凋亡细胞的吞噬能力，发现TonEBP缺失的PMs表现出更高的吞噬活性（图10b-c）。这些数据表明，巨噬细胞中的TonEBP阻止凋亡细胞的吞噬，与吞噬活性相关基因的表达降低有关。
       总之，从小鼠中获得的数据表明，巨噬细胞中的TonEBP通过激活NF-kB和IRF3^/7磷酸化，抑制胞葬作用，刺激自身免疫反应、抗原呈递和Th1^/Th17细胞发育，从而参与SLE^/LN的发病（图10d）。

图10 髓系TonEBP缺乏阻断TLRs介导的凋亡细胞清除恶化

实验方法
       qRT-PCR，杂合TonEBP小鼠（TonEBP^+/; Nfat5^+/tm1Snh），小鼠SLE模型
参考文献
Yoo EJ, Oh KH, Piao H, Kang HJ, Jeong GW, Park H, Lee CJ, Ryu H, Yang SH, Kim MG, Kim DK, Park SH, Lim BJ, Lee SM, Park CY, Choi SY, Lee-Kwon W, Yang J, Kwon HM. Macrophage transcription factor TonEBP promotes systemic lupus erythematosus and kidney injury via damage-induced signaling pathways. Kidney Int. 2023 Apr 22:S0085-2538(23)00261-2. doi: 10.1016/j.kint.2023.03.030