ZBP1可预防mtDNA诱导的衰竭心脏的心肌炎症
栏目：最新研究动态
发布时间：2023-08-23
ZBP1（Z-DNA 结合蛋白1）是一种模式识别受体，可响应炎症细胞、成纤维细胞和内皮细胞中的mtDNA 而积极调节炎症......
心力衰竭（HF）的患病率和发病率正在上升，并被定义为一种全球大流行，影响全球约26万人。尽管治疗取得了重大进展，但HF的发病率和死亡率仍然很高。因此，需要对HF的病理生理学和分子机制有新的见解来开发新的治疗方法。线粒体DNA（mtDNA）诱导的心肌炎症与心脏重塑密切相关。ZBP1（Z-DNA 结合蛋白1）是一种模式识别受体，可响应炎症细胞、成纤维细胞和内皮细胞中的mtDNA 而积极调节炎症。然而，ZBP1在心肌炎症和心脏重塑中的作用尚不清楚。该研究发表于《Circulation Research》，IF：23.213。
技术路线：
主要研究结果：
1. mtDNA增加ZBP1并激活心肌细胞中的炎症信号传导
为了评估心肌细胞中ZBP1对mtDNA的表达，作者将1000ng / mL从大鼠肝脏中提取的mtDNA施用到心肌细胞中，通过检测mtDNA的一部分Cox1而不是核DNA的一部分At3来验证其纯度（图1A）。从mtDNA给药24小时后，作者发现ZBP1 mRNA和蛋白质水平增加（图1B和1C）随着IL-1β和IL-6 mRNA水平的增加（图1D）。
此外，作者研究了ZBP1和其他与炎症相关的蛋白质的mtDNA剂量依赖性反应，包括微管相关蛋白1A / 1B- LC3（轻链3），RIPK3，磷酸化的NF-κB p65亚基（Ser536）和NLRP3。虽然低剂量的mtDNA（100 ng/mL）增加了LC3-II，但没有增加ZBP1，但高剂量的mtDNA（1000 ng/mL）增加了LC3-II和ZBP1（图1E和1F）。重要的是，只有高剂量的mtDNA才能增加RIPK3，磷酸化的NF-κB，NLRP3和磷酸化TBK1的蛋白质水平，它们是炎症的主要介质（图1F）。此外，高剂量的mtDNA增加了IL-1β和IL-6的mRNA水平，而低剂量则没有（图1G）。这些数据表明，虽然低剂量的mtDNA通过自噬激活和处理，如LC3-II的增加所证明的那样，高剂量的mtDNA不仅诱导自噬，而且还增加ZBP1和其他炎症相关蛋白，导致心肌炎症。
图1 mtDNA增加ZBP1并激活心肌细胞中的炎症信号传导
2. ZBP1敲低加剧了用mtDNA处理的心肌细胞中炎症细胞因子的增加
接下来，作者研究了ZBP1在心肌细胞中响应1000 ng / mL mtDNA的功能作用。小干扰RNA敲低有效抑制了ZBP1的mRNA和蛋白质水平（图2A和2B）。出乎意料的是，尽管ZBP-1已被报道介导炎症，但ZBP1敲低加剧了mtDNA诱导的RIPK3，磷酸化NF-κB和NLRP3的增加（图2B）。与这些结果一致，ZBP1敲低进一步增加了用mtDNA处理的心肌细胞中IL-1β和IL-6的mRNA水平（图2C）。TBK1是ZBP1的另一个下游靶标。尽管高剂量的mtDNA增加了TBK1的磷酸化（图1F），ZBP1敲低没有影响它（图2D）。这些发现表明，ZBP1负调节心肌细胞中的RIPK3，NF-κB和炎性细胞因子，但不是TBK1。
图2 ZBP1敲低会加剧用mtDNA处理的心肌细胞中炎性细胞因子的增加
3. 在mtDNA处理的心肌细胞中，敲低RIPK3可通过敲低ZBP1抵消NF-κB-NLRP3轴的增加
为了研究ZBP1和RIPK3之间的关系，并阐明RIPK3是否可以介导炎症作为ZBP1的下游靶标，作者进行了ZBP1和RIPK3的双重敲低实验。双敲低有效降低了这些蛋白质（图3A）。重要的是，RIPK3敲低减弱了mtDNA处理的心肌细胞中ZBP3敲低磷酸化NF-κB和NLRP1增加的恶化（图3A）。RIPK3敲低也降低了IL-1β和IL-6的mRNA水平（图3B）。这些发现表明RIPK3正调控NF-κB和NLRP3，ZBP1通过抑制RIPK3发挥抗炎作用。相反，mtDNA和ZBP1敲低都不影响细胞存活（图3C），表明ZBP1-RIPK3轴不能直接调节心肌细胞死亡。
图3在mtDNA处理的心肌细胞中，敲低RIPK3可通过敲低ZBP1抵消NF-κB-NLRP3轴的增加
4. 在mtDNA处理的心肌细胞中，敲低NF-κB抑制了ZBP1敲低引起的NLRP3轴的增加
接下来，作者研究了NF-κB是否可以介导炎症作为ZBP1的下游靶标。作者发现NF-κB敲低减轻了mtDNA处理的心肌细胞中ZBP3敲低NLRP3增加的恶化，但不能减轻RIPK1的恶化（图4A）。重要的是，这些变化伴随着IL-1β和IL-6的mRNA水平的降低（图4B）。综上所述，这些数据表明ZBP1通过抑制NF-κB途径发挥抗炎作用。
图4 在mtDNA处理的心肌细胞中，敲低NF-κB抑制了ZBP1敲低引起的NLRP3轴的增加
5. ZBP1负调节CpG-寡脱氧核苷酸处理的心肌细胞中的炎症反应
众所周知，ZBP1可以感知线粒体和核DNA。为了鉴定刺激心肌细胞中ZBP1的DNA类型，作者使用了模拟mtDNA的CpG-寡脱氧核苷酸和模拟核DNA的对照寡脱氧核苷酸。作者发现异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CpG-寡脱氧核苷酸与mcherry标记的ZBP1共定位（图5A）。5CpG-寡脱氧核苷酸增加ZBP1 mRNA和蛋白质水平（图5B和5C）和ZBP1敲低进一步增加了用CpG-寡脱氧核苷酸处理的心肌细胞中IL-1β和IL-6的mRNA水平（图5D）。这些发现表明，ZBP1可以感知心肌细胞中的线粒体和核DNA，并负向调节炎症以响应它们。
图5 ZBP1和CpG-ODN的相互作用参与ZBP1在CpG-ODN处理的心肌细胞中的抗炎作用
6. TLR9 敲低通过抑制 RIPK3、NF-κB 和 NLRP3 来改善 mtDNA 或 CpG-寡脱氧核苷酸处理的心肌细胞中的炎症反应
接下来，作者试图研究mtDNA处理的心肌细胞中TLR9，ZBP1和RIPK3之间的关系。CpG-寡脱氧核苷酸，也称为TLR9刺激剂，被发现增加心肌细胞中的RIPK3表达（图5E），表明RIPK3是TLR9的下游。作者证实TLR9敲低有效地降低了其mRNA水平（图5F）。此外，作者发现TLR9敲低增强了mtDNA诱导的心肌细胞中ZBP1 mRNA和蛋白质水平的增加（图5G和5H）和加剧的CpG-寡脱氧核苷酸诱导的ZBP1增加（图5I）。这些数据表明ZBP1阻碍了mtDNA和TLR9之间的相互作用，从而预防了下游炎症信号传导。
7. 心肌梗死后衰竭心脏的ZBP1和胞质mtDNA增加
为了评估ZBP1在衰竭心脏中的作用，作者在小鼠中进行了MI的体内实验。作者在MI模型中验证了梗死。作者发现，心肌梗死术后1天，心肌梗死后心脏非梗死区域的ZBP3蛋白水平升高（图6A）。接下来，作者分析了MI模型中胞质部分的DNA水平。作者对GAPDH、线粒体标志物COX4和自噬标志物LC3进行了免疫印迹验证了胞质组分的纯度（图6B）。Dloop是mtDNA的一种成分，在细胞溶质部分中在对照心脏中大量检测到，并在MI后心脏中增加（图6B）。相反，核DNA的组成部分Tert和B2m在对照和心肌梗死后心脏中均略有检测到（图6B）。总体而言，这些数据表明ZBP1与衰竭心脏中胞质mtDNA的增加有关。
图6 ZBP1敲除通过 RIPK3-NF-κB-NLRP3途径增强衰竭心脏的心肌炎症
8. ZBP1 敲除加剧心功能不全和心肌梗死后重塑
ZBP1基因敲除小鼠在心肌梗死后左心室（LV）舒张和收缩压直径增加，左心室射血分数降低，心脏衰竭部分缩短（图7A）。ZBP1敲除也加剧了全心重和左心室体重的增加（图7B）。在病理分析中，ZBP1敲除增强了衰竭心脏的胶原蛋白体积，这是心脏纤维化的指标，但不是横截面积，心肌细胞肥大的指数（图7C）。这些数据表明，ZBP1 敲除会加剧心肌梗死后的心功能不全和重塑。
图7 ZBP1敲除会加剧心肌梗死后的心功能障碍和重塑
结论：
ZBP1作为RIPK3-NF-κB通路的心肌炎症内源性抑制因子，在心脏重塑中起保护作用。旨在通过ZBP1干扰心肌炎症的治疗策略可能有助于预防心脏重塑和衰竭。
示意图：
ZBP1在心肌炎症和重塑中的作用示意图
实验方法：
细实时聚合酶链反应，免疫印迹，细胞活力检测，动物实验
参考文献：
Enzan N, Matsushima S, Ikeda S, Okabe K, Ishikita A, Yamamoto T, et al. ZBP1 Protects Against mtDNA-Induced Myocardial Inflammation in Failing Hearts. Circ Res. 2023 Apr 28;132(9):1110-1126.