CircZBTB44通过稳定HK3 mRNA结构促进肾癌进展

       CircZBTB44 （hsa_circ_0002484）已被确定在肾细胞癌（RCC）组织中表达上调，但其在RCC中的作用和贡献尚不明确。作者证实了RCC细胞中circZBTB44的过度表达。在异种移植小鼠模型中，敲低CircZBTB44抑制了RCC细胞的活力、增殖和迁移，并抑制了肿瘤的发生。异质核糖核蛋白C （HNRNPC）和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3 （IGF2BP3）是circZBTB44的两种RNA结合蛋白。HNRNPC通过m6A修饰促进circZBTB44从细胞核向细胞质的易位，促进了RCC细胞细胞质中IGF2BP3和circZBTB44的相互作用。此外，circZBTB44通过与IGF2BP3结合，在RCC细胞中上调己糖激酶3 （HK3）的表达。HK3对RCC细胞的恶性行为和肿瘤生长具有致瘤作用。在RCC细胞与巨噬细胞共培养中，circZBTB44通过上调HK3促进巨噬细胞M2极化。综上所述，HNRNPC介导circZBTB44与IGF2BP3相互作用上调HK3，在体外促进RCC细胞的增殖和迁移，在体内促进肿瘤发生。本研究结果为RCC的靶向治疗提供了新的思路。本文于2023年4月发表在《Molecular Cancer》IF：41.444期刊。

技术路线：

主要实验结果：
1、circZBTB44在RCC组织和细胞中的表达
       作者对GSE100186、GSE108735和GSE137836数据集进行分析，结果显示，CircZBTB44 （hsa_circ_0002484）在RCC肿瘤组织中表达上调（图1A）。随后证实了circZBTB44在RCC细胞中的表达高于人肾近端小管上皮细胞（HK-2），特别是在A498和769-P细胞中（图1B）。CircZBTB44 （chr11:130130750 - 130131824）位于第11号染色体上，与宿主基因ZBTB44外显子2反向剪接（图1C）。从PCR和电泳分析结果来看，circZBTB44仅在cDNA中扩增，在gDNA中未观察到扩增产物（图1D）。此外，作者还发现，与ZBTB44 mRNA相比，circZBTB44对RNase R处理具有抗性，这表明由于其圆形结构，circZBTB44比其线性mRNA更稳定（图1E）。FISH和亚细胞分离实验显示，circZBTB44在RCC细胞的细胞质和细胞核中均有分布，细胞质中circZBTB44较多（图1F-G）。

图1 circZBTB44在RCC组织和细胞中的表达

2、CircZBTB44促进体外RCC细胞发育和体内小鼠肿瘤发生
       通过一系列功能实验研究circZBTB44对RCC细胞恶性行为的影响。转染si-circZBTB44-1/-2/-3后，RCC细胞中circZBTB44的表达显著降低，ZBTB44 mRNA的表达不受si-circZBTB44的影响。si-circZBTB44-1和sicircZBTB44-2质粒表现出较好的沉默效果，并应用于后续实验（图2A）。然后作者评估了RCC细胞的活力和增殖潜力，发现circZBTB44-2沉默对RCC细胞的体外生长有明显的抑制作用（图2B-C）。此外，相对于对照组，si-circZBTB44-1/-2组中迁移的RCC细胞数量显著减少（图2D）。敲低circZBTB44可减少RCC细胞的创面愈合距离（图2E），表明沉默circZBTB44可显著抑制RCC细胞的迁移能力。研究表明，CircZBTB44在RCC细胞生长和迁移中起癌症启动子的作用。然后作者在体内检测了circZBTB44基因敲低对小鼠肿瘤生长的影响。与对照组相比，si-circZBTB44组小鼠肿瘤组织样本中的circZBTB44水平显著降低（图2F）。si-circZBTB44组与对照组相比，肿瘤大小和重量明显减小（图2G-H）。同样地，沉默circZBTB44后，肿瘤生长速度降低（图2I）。此外，免疫组化染色结果显示，circZBTB44沉默导致Ki-67蛋白表达明显降低，表明circZBTB44在体内刺激肿瘤生长（图2J）。
 

  
图2 CircZBTB44在体外促进RCC细胞恶性

3、CircZBTB44在RCC细胞中与HNRNPC和IGF2BP3相互作用
       作者基于RBPsuite网站的预测和RNA pull-down-ms的结果，进一步探讨circZBTB44在RCC中的调控机制。结果显示HNRNPC和IGF2BP3可能与circZBTB44相互作用（图3A）。接着作者检测了circZBTB44沉默对HNRNPC和IGF2BP3表达的影响，qRT-PCR结果表明，RCC细胞中circZBTB44沉默对HNRNPC和IGF2BP3的表达没有显著影响（图3B）。RNA pull-down实验显示，HNRNPC和IGF2BP3在bio-circZBTB44复合物中大量富集，这表明circZBTB44在RCC细胞中与HNRNPC和IGF2BP3相互作用（图3C）。同样，作者观察到circZBTB44在抗HNRNPC和抗IGF2BP3的沉淀中丰富富集，这证实了circZBTB44与HNRNPC或IGF2BP3之间的相互作用（图3D）。人类蛋白质图谱预测HNRNPC主要分布在细胞核中，IGF2BP3主要位于细胞质中（图3E），免疫荧光实验进一步证实了这一点（图3F）。最后作者评估了HNRNPC和IGF2BP3之间的相互作用，结果显示HNRNPC和IGF2BP3之间没有直接的相互作用（图3G）。

图3 CircZBTB44在RCC细胞中与HNRNPC和IGF2BP3相互作用。

4、HNRNPC增强了circZBTB44和IGF2BP3的相互作用并通过m6A修饰介导circZBTB44向细胞质的易位
       HNRNPC是一种N6 -甲基腺苷（m6A）解读器，调控RNA剪接、3’端加工和翻译等RNA加工。假设HNRNPC参与了circZBTB44的调控。qRT-PCR结果验证了siHNRNPC和siIGF2BP3在RCC细胞中转染后， HNRNPC和IGF2BP3在RCC细胞中的表达显著降低（图4A）。MeRIP检测结果显示，circZBTB44在抗m6 A沉淀中显著富集，沉默HNRNPC后抗m6A减少，而在RCC细胞中敲除IGF2BP3后无明显变化，提示HNRNPC影响了circZBTB44的m6 A修饰（图4B）。此外，作者使用SRAMP数据库预测circZBTB44的m6A修饰位点，发现了4个具有高置信度的m6A位点（图4C）。然后对4个m6A位点进行突变，RNA pull- down实验结果表明，HNRNPC在Bio-circZBTB44-s3Mut拉下的复合物中不富集（图4D）。然后检测circZBTB44在细胞质和细胞核中的表达，qRT-PCR结果显示，HNRNPC敲低显著降低了circZBTB44的细胞质分布，提高了circZBTB44在RCC细胞细胞核中的表达（图4E）。作者进一步探讨了HNRNPC对circZBTB44和IGF2BP3相互作用的影响，HNRNPC缺失明显降低了Bio-circZBTB44复合物中IGF2BP3的富集，提示HNRNPC沉默抑制了RCC细胞中circZBTB44和IGF2BP3的相互作用（图4F）。同样，RIP实验结果表明，circZBTB44富集后，抗IGF2BP3的沉淀显著减少（图4G）。总体而言，HNRNPC通过m6A修饰促进circZBTB44向细胞质易位，增强了circZBTB44与IGF2BP3的相互作用。

图4 HNRNPC增强了circZBTB44和IGF2BP3的相互作用并通过m6 A修饰介导circZBTB44向细胞质的易位

5、CircZBTB44与IGF2BP3结合调节HK3 mRNA稳定性
       IGF2BP3与mRNA结合，调控靶基因表达。因此，作者对circZBTB44/IGF2BP3的下游靶点进行了研究。根据catRAPID数据库预测的结果和之前的研究，发现HK3很可能与IGF2BP3结合，并且在RCC中也上调（图5A）。作者检测了circZBTB44敲低对HK3表达的影响，在circZBTB44沉默的RCC细胞中，HK3显著下调（图5B）。在HK3 3'UTR复合物中观察到IGF2BP3的富集，这表明在RCC细胞中IGF2BP3与HK3 3'UTR结合（图5C）。RIP实验显示，HK3 3'UTR复合物在抗IGF2BP3的沉淀中富集（图5D）。α-amanitin处理并在RCC细胞中沉默IGF2BP3后，HK3 mRNA的稳定性显著降低（图5E）。FISH检测结果显示，circZBTB44、IGF2BP3和HK3在RCC细胞的细胞质中共定位（图5F）。RIP实验显示，在circ ZBTB44沉默的RCC细胞中，抗IGF2BP3沉淀中HK3 3'UTR的富集显著减少（图5G）。qRT-PCR分析证实了circZBTB44的过表达效率（图5H）。作者还观察到，在RCC细胞中，IGF2BP3敲除后，HK3的表达下调，并通过过表达circZBTB44而被逆转（图5I）。

图5 CircZBTB44与IGF2BP3相互作用调节HK3 mRNA的稳定性。

6、HK3在体外和体内均促进RCC的生长和转移
       作者研究了HK3对RCC细胞发生的影响。qRT-PCR和western blot分析显示，转染si-HK3-1/-2/-3后，RCC细胞中HK3的表达显著降低（图6A）。研究表明，HK3敲低可显著抑制RCC细胞的生存能力和增殖能力（图6B-C）。此外，相对于对照组，si-HK3-1和si-HK3-2组的RCC细胞迁移能力显著降低（图6D-E）。利用荷瘤小鼠模型评估HK3缺乏对RCC肿瘤发生的影响，qRT-PCR和western blot分析显示，sh-HK3组小鼠肿瘤组织中HK3的表达明显下调（图6F-G）。与对照组相比，缺乏HK3导致小鼠肿瘤重量和体积显著减少（图6H-I）。此外，小鼠肿瘤组织中的Ki67蛋白因HK3缺乏而减少，这表明HK3敲低抑制了体内RCC的肿瘤发生（图6J）。

图6 HK3在体外和体内均促进RCC的生长和转移

7、CircZBTB44通过上调HK3促进RCC生长和转移
       作者进行了救援试验，以检验HK3是否在circZBTB44对RCC进展的调节中发挥作用。利用pcDNA3.1/ HK3载体过表达HK3，通过qRT-PCR验证转染效率（图7A）。作者发现circZBTB44诱导RCC细胞活力下降，并且HK3过表达后EdU阳性细胞比例明显恢复（图7B-C）。沉默circZBTB44后，迁移的RCC细胞数量和RCC细胞的伤口愈合距离减少，发现这与HK3上调相抵消（图7D-E）。此外，circZBTB44缺失诱导的异种移植物肿瘤重量、体积和生长速度的下降被HK3过表达显著逆转（图7F-G）。与sh-circ+oe-NC组相比，circZBTB44敲低组小鼠肿瘤组织中Ki67蛋白表达降低，HK3过表达升高（图7H）。

图7 CircZBTB44通过上调HK3促进RCC生长和转移

8、CircZBTB44通过上调HK3促进巨噬细胞M2极化
       前人研究表明，HK3通过刺激浸润的单核细胞或巨噬细胞表面标记物的丰度，促进RCC细胞的免疫逃逸。因此，作者探索circZBTB44是否通过调节HK3来调节单核细胞或巨噬细胞的M2极化。M0巨噬细胞与RCC细胞共培养诱导TAMs （图8A）。流式细胞术显示，circZBTB44沉默显著降低了CD86⁺CD206⁻巨噬细胞的比例，升高了CD206+CD86−巨噬细胞的比例，这一现象被HK3过表达逆转（图8B）。在与RCC共培养的巨噬细胞中检测M1相关基因（CD86、TNF-α）和M2相关基因（CD206、ARG-1）的表达。结果显示，circZBTB44沉默降低了CD206和ARG-1的表达，增加了CD86和TNF-α的水平，而HK3过表达可显著拯救CD206和ARG-1的表达（图8C-D）。

图8 CircZBTB44通过上调HK3促进巨噬细胞M2极化

实验方法
       生物信息学分析，RNase R消化实验，qRT-PCR，Western blot，Rescue assays，RNA干扰，过表达，细胞迁移实验，细胞划痕实验，EdU化验，细胞活力测定，免疫荧光染色，荧光原位杂交（FISH），甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP），免疫组化（IHC），RNA pull-down，GST pull-down，RNA免疫沉淀（RIP），异种移植小鼠模型，RCC细胞与巨噬细胞共培养，流式细胞术。
参考文献：
Li TS, Gu Y, Xu BC, Kuca K, Zhang J, Wu WD. CircZBTB44 promotes renal carcinoma progression by stabilizing HK3 mRNA structure. 2023, April, 22（1）: 77. https://doi.org/10.1186/s12943-023-01771-5.