你还不知道怎么选关键基因吗？生信 加简单的实验验证轻松发高分
溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性非特异性炎症性疾病，一般局限于结肠粘膜和粘膜下层。最近的研究表明，铁死亡可能参与UC的过程。然而，UC中的铁死亡机制仍有待于进一步研究。本研究基于生物信息学挖掘到UC中铁死亡相关的关键基因LCN2，进一步功能实验证实LCN2是调节UC中铁死亡形成的一个关键因素，为铁死亡在UC中的重要作用提供了额外的证据。本研究于2023年3月发表在《Inflammatory Bowel Diseases》IF：7.29期刊上。
技术路线
主要实验结果：
1、鉴定WGCNA模块的关键基因和DEGs及其功能分析
利用UC的GEO数据进行WGCNA分析，获得13个模块，其中navajowhite、darkolivergreen模块和临床指标高度相关（图1A）。利用GSE87466数据集鉴定DEGs，共获得910个DEGs，UC组有575个上调和335个下调（图1B）。DEGs和上述两个模块的交集是878个基因（图1C）。
对上述获得基因进行功能分析。GO的生物过程富集分析表明，这些基因主要富集与免疫相关通路相关的功能，包括“对细菌源分子的反应”、“体液免疫反应”和“对LPS的反应”（图1D）。细胞成分分析主要富集于“质膜外侧”和“质膜外侧”（图1E），MF分析主要富集于“趋化因子受体结合”和“趋化因子活性”（图1F）。KEGG分析发现这些基因主要途径是细胞因子-细胞因子受体相互作用”（图1G）。最后，进行了GSEA分析，结果主要富集在“IL−17信号通路”（图1H）。
在对浸润进行免疫学分析后，发现UC组与对照组在免疫细胞百分比上有显著差异（图1I）。UC的存在与具有记忆激活的T细胞CD4、滤泡辅助性T细胞、γ δ T细胞、巨噬细胞M0、巨噬细胞M1、活化的树突状细胞、活化的肥大细胞和中性粒细胞水平显著升高相关。相反，UC患者表现出明显较低水平的T细胞CD8，T细胞CD4记忆静息状态，T细胞调节性(Tregs)， NK细胞活化，单核细胞，M2巨噬细胞和肥大细胞静息状态。
图1筛选溃疡性结肠炎相关基因
2、选择和验证与临床表型和免疫细胞高度相关的铁死亡相关DEGs
将上述878个基因与铁死亡相关基因取交集，得到UC中9个铁死亡相关DEGs。为进一步探索其机制，从STRING数据库中构建一个PPI网络，并在cytoscape中的MOODE插件上进行了验证，颜色越深，相关性越高（图2A）。随后分析了与铁死亡相关的DEG与免疫基因的相关性（图2B）。结果显示，铁死亡相关DEGs均与免疫基因存在不同程度的相关性，尤其是LCN2。最后，可视化铁死亡相关的DEGs在UC组和正常组中的表达，发现除了BSG，它们在UC组中均高表达（图2C-2K）。
图2 PPI网络与凋亡相关DEGs的表达
3、LCN2是随机森林模型中最具决定性的基因
由于一些基因已经被证明与铁死亡相关，最终选择LCN2，BSG，ANXA5和MUC1进行随机森林模型构建。GSE87466的内部验证验证结果为阳性，表现为极高的置信水平(AUC = 1)和无可挑剔的分类性能（图3A）。这些结果表明，GSE87466是一个可靠和有效的分类器。基于测试集GSE47908的评估，有明显的高水平置信（AUC = 0.94；图3B）。同时，还可以看到测试集GSE47908中的4个基因在UC组和正常组中存在显著差异表达（图3C）。在测试集和训练集模型中，LCN2对模型的作用最大（图3D-E）。ROC曲线分析LCN2在验证集和测试集的诊断性能均显示出较好的AUC值（图3F-G）。以上表明LCN2是随机森林模型中最具决定性的基因。因此，选择LCN2用于后续分析。
图3 UC的4个基因的随机森林预测模型
4、UC中发生铁死亡和LCN2高表达
通过构建LPS/IFN-γ诱导iBMDM呈M1样巨噬细胞的炎症模型模拟结肠炎的炎症过程，探讨LCN2基因在UC中的作用。如图4A所示，LPS/IFN-γ刺激引起的脂质过氧化水平增加，这一趋势可以被Fer-1预处理逆转。为进一步验证UC病理过程中铁死亡的存在，使用FerroOrange探针检测Fe2+含量的变化，LPS/IFN-γ刺激可诱导细胞内铁含量的积累，而Fer-1处理可恢复细胞内Fe2+水平（图4B）。此外，观察到LPS/IFN-γ刺激后ACSL4、COX2和LCN2蛋白水平显著上调，而GPX4和FTH1表达下降（图4C）。这些结果表明LPS/IFN-γ可以诱导iBMDM模拟的肠炎模型中铁死亡的进展并增加LCN2的表达。
图4 LPS/IFN-γ刺激iBMDM极化并模拟结肠炎的炎症过程
5、LCN2沉默抑制UC铁死亡
为探究LCN2在UC铁死亡中的作用，在iBMDM和Caco-2细胞中敲低LCNE2的表达（图5A）。结果显示敲低LCN2可降低LPS/IFN-γ刺激iBMDM细胞和LPS刺激Caco-2细胞诱导的脂质过氧化水平（图5B）。采用共聚焦显微镜或多功能微孔检测系统检测Fe2+含量。如图5E所示，与对照组相比，LCN2敲低降低LPS/IFN-γ处理的iBMDM细胞和LPS刺激的Caco-2细胞中亚铁含量的增加。此外，在炎症模型中，LCN2敲低降低ACSL4和COX-2蛋白水平，而SLC7A11、GPX4和FTH1蛋白水平升高（图5C-D）。同样，UC模型中ACSL4和FTH1的表达被LCN2敲低逆转（图5C-D）。综上所述，敲低LCN2可以抑制UC中的铁死亡，从而延缓UC的进展。
图5 敲低LCN2抑制UC细胞的铁死亡
6、LCN2介导的铁死亡导致DSS诱导的UC
为进一步验证LCN2作为UC的铁死亡相关因子的存在，用Fer-1预处理小鼠，并让小鼠自由饮用含有3%DSS的饮用水，诱导UC模型。结果如图6A-C所示；DSS组表现出明显的UC症状，包括体重明显下降，DAI评分明显增加，结肠长度明显缩短。然而，使用Fer-1后，明显扭转了这些变化。H&E染色结果显示，DSS组表现出明显的炎症细胞浸润、粘膜损伤和其他病理症状，Fer-1可以缓解这些症状（图6D）。免疫组化结果显示，Fer-1缓解了DSS诱导的UC中紧密连接蛋白（Occludin、ZO-1、Claudin-1）的表达减少（图6E）。这表明靶向铁死亡形成是治疗UC的一个很有前途的途径。
此外，结果显示，在DSS诱导的UC中，GPX4的表达被下调，而ACSL4和LCN2的表达被上调，这些变化可以被Fer-1抵消（图6F）。总之，LCN2与UC中的铁死亡密切相关，抑制铁死亡可以减少LCN2的表达，改善UC小鼠。
图6 LCN2介导的铁死亡参与DSS诱导的UC
总之，在这项研究中，作者发现在LPS/IFN-γ诱导的巨噬细胞极化的炎症模型和DSS诱导的UC小鼠模型中，LCN2高度表达，并与UC铁死亡的发生密切相关。更重要的是，沉默LCN2抑制了巨噬细胞极化的炎症模型和LPS刺激的Caco-2细胞UC模型中的铁变性事件。研究表明，LCN2是调节UC中铁死亡形成的一个关键因素，而抑制LCN2会抑制UC中的铁死亡形成。
实验方法：
GEO数据下载，WGCNA分析，GSEA分析，DEG鉴定和功能富集，CIBERSORT分析，PPI分析，构建随机森林模型，细胞培养和转染，脂质过氧化实验，WB，铁离子浓度检测，UC动物建模，HE染色，IHC
参考文献：
Deng L, He S, Li Y, Ding R, Li X, Guo N, Luo L. Identification of Lipocalin 2 as a Potential Ferroptosis-related Gene in Ulcerative Colitis. Inflamm Bowel Dis. 2023 Mar 31:izad050. doi: 10.1093/ibd/izad050. Epub ahead of print. PMID: 37000707.