抑制ALKBH5通过促进Ccl28 m6A修饰和增加Treg募集来减轻雄性小鼠肾损伤

       缺血再灌注损伤(IRI)是急性肾损伤(AKI)的常见原因。AKI中m6A修饰的作用尚不清楚。在这里，我们描述了ALKBH5和m6A修饰在I/R诱导的雄性小鼠肾损伤模型中的作用。与野生型小鼠相比，Alkbh5敲除小鼠IRI后的病理损伤较轻，肾功能较好，而Alkbh5敲入小鼠则相反。此外，在管上皮细胞中条件敲除Alkbh5可减轻I/R诱导的AKI和纤维化。CCL28被确定为ALKBH5的靶标。此外，随着Alkbh5缺乏，Ccl28 mRNA的稳定性增加。在IRI-Alkbh5^fl/fl Ksp^Cre小鼠中，升高的CCL28水平上调了Treg募集，抑制了炎症细胞。ALKBH5抑制剂IOX1对I/R诱导的AKI具有保护作用。综上所述，抑制ALKBH5可促进Ccl28 mRNA的m6A修饰，增强其稳定性，调节Treg/炎症细胞轴。ALKBH5和这个轴是一个潜在的AKI治疗靶点。本文于2023年3月发表于Nature Communications（IF=16.6）上。
技术路线

结果
1）m6A修饰和ALKBH5参与肾脏IRI和mRTECs的缺氧和复氧(H/R)反应
       为了研究m6A修饰是否参与肾IRI，我们检测了从IRI小鼠肾组织中提取的RNA的m6A水平。m6A水平在IRI后12小时开始下降，但在24小时和48小时急剧上升，然后在IRI后120小时恢复到接近正常水平(图1a)。为了确定哪些m6A修饰的调控因子在IRI中起作用，我们使用GEO数据库的数据进行了单细胞测序分析，发现去甲基化酶Alkbh5是最显著的改变基因(补充图，未展示)。然后，我们测量了肾组织中几种已知的m6A甲基转移酶和去甲基化酶相关蛋白的RNA表达水平。Alkbh5的表达在12 h时升高，在24 h和48 h时下降，IRI后120 h开始恢复(图1b)。其他调节因子的变化如图1b所示，其中Alkbh5的变化最为明显。这些蛋白的Western blotting (WB)分析显示了相同的变化，与实时定量PCR (RT-qPCR)结果一致(图1c)。莲藕凝集素(LTL)和ALKBH5的免疫荧光(IF)染色显示，ALKBH5主要在RTECs中表达，并在IRI后24 h表达减少(图1d)。H/R应用于mRTECs。随后，测定m6A修饰、m6A甲基转移酶和去甲基化酶mRNA表达水平。结果显示，与对照组相比，H/R组(6 H和12 H复氧)的m6A修饰增加(图1e)。H/R组Alkbh5、Fto、和Wtap mRNA表达下调，Mettl3和Mettl14 mRNA表达上调(图1f)。WB分析也验证了类似的结果(图1g)。这些数据表明，常见的m6A甲基转移酶和去甲基化酶，尤其是ALKBH5的表达水平在肾脏IRI过程中发生了显著变化，表明m6A修饰可能在这一过程中发挥了重要作用。

2）Alkbh5缺乏和过表达改变了I/R诱导的AKI和纤维化
       为了研究ALKBH5在肾IRI中的作用，我们构建了ALKBH5敲除(KO)和ALKBH5敲入(KI)小鼠。随后，我们对WT、KO和KI小鼠进行了45分钟的单侧肾蒂夹持或假手术(图2a)。在IRI-KO和IRI-KI组中，m6A甲基化分别高于和低于IRI-WT组(图2b, c)。在Sham-WT、Sham-KO和Sham-KI组中，无论是在肾功能分析(包括血清肌酐和血尿素氮(BUN))(图2d-g)还是在病理评分分析(图2h-k)中，都没有显著差异。然而，在IRI组中，KO小鼠表现出更好的肾功能(血清肌酐和BUN降低；图2d, f)，轻度肾损害(图2h-j)，肾细胞凋亡较少(图2l)。相应地，IRI-KI小鼠表现出更差的肾功能(图2e, g)，更严重的肾损害(图2k)。IRI后4周采用Sirius red和Masson染色检测肾纤维化的严重程度，结果显示IRI-KO小鼠比IRI-WT小鼠表现出更少的阳性染色点(图2,n)。我们的数据显示，Alkbh5缺乏可防止I/R诱导的AKI和纤维化。相反，Alkbh5过表达加重了I/R后的肾损伤。

3）RTECs中Alkbh5缺乏保护I/R诱导的AKI和纤维化
       为了研究RTECs中Alkbh5的缺失是否对肾IRI具有保护作用，我们将Alkbh5^fl/fl小鼠与Ksp^Cre小鼠杂交，构建了Alkbh5-cKO小鼠。免疫荧光染色(图3b)验证了RTECs中Alkbh5的缺失。随后，我们在Alkbh5^fl/fl和Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠中诱导IRI(图3a)。m6A点印迹显示，与IRI-Alkbh5^fl/fl组相比，IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre组m6A甲基化进一步增加(图3c)。假手术小鼠的血清肌酐和BUN水平在Alkbh5^fl/fl和Alkbh5^fl/flKsp^Cre之间无显著差异(图3d, e)，但IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre组在IRI后24 h和48 h的血清肌酐和BUN水平均显著低于IRI-Alkbh5^fl/fl组(图3d, e)。接下来，我们在IRI后24小时收集四组肾脏组织进行病理分析。H&E和PAS染色显示，RTECs中Alkbh5缺乏减轻了I/R后肾损伤(图3f-h)。此外，TUNEL染色也显示Alkbh5 cKO可以减少细胞凋亡(图3i)。这些数据表明，RTECs中Alkbh5的缺失对I/R诱导的AKI具有保护作用。为了进一步确定Alkbh5缺乏在I/R 4周后慢性肾损伤中的作用，我们进行了天狼星红和Masson染色。IRI-Alkbh5^{fl/ fl}Ksp^Cre组比IRI-Alkbh5fl/fl组表现出较轻的纤维化(图3j, k)。总的来说，RTECs中Alkbh5缺乏有效地保护了I/R后的AKI和慢性纤维化。

4）Alkbh5-KO小鼠m6A修饰及基因表达变化的表征
       为了确定肾脏IRI开始时ALKBH5的直接m6A去甲基化靶点，我们在I/R后24小时使用WT和KO小鼠IRI小鼠肾脏分离的RNA进行了甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)和RNA测序(RNA-seq)。根据MeRIP-seq分析，m6A修饰通常位于一致的“RGAAR”基序(R = a或G)(图4a)。m6A峰在终止密码子附近尤其丰富(图4b, c)。MeRIP-seq分析发现KO组有1754个高甲基化峰。RNA-seq结果显示，与WT组相比，KO组有1779个基因表达上调，1331个基因表达下调(图4d)。使用RNA-seq和MeRIP-seq数据进行KEGG分析，揭示了与免疫和代谢相关的多种信号通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号、IL-17信号等(图4e、f)。为了进一步评估相应基因的mRNA表达和m6A甲基化水平，我们选择了差异表达最多的基因(图4g、4h)。此外，我们使用四象限散点图对四个不同的亚群及其功能进行了深入的数据分析(图4i)。为了找到ALKBH5最可能的直接靶基因，我们选择了与高甲基化相关的上调或下调最多的基因，如Ccl28、Sh2d5、Ngfr和Tfr2(图4i)。在MeRIP-seq数据中，我们发现KO组在Ccl28 mRNA的停止密码子周围有一个m6A峰，而在WT组中减少(图4j)。Ccl28是表达倍数变化最大的显著差异表达基因，因此我们假设Ccl28是ALKBH5的直接靶基因。

5）CCL28是ALKBH5的直接靶点
       采用RT-qPCR、WB和免疫组化(IHC)检测IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre组和IRI-Alkbh5^fl/fl组Ccl28的表达水平。结果显示，在Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠中，CCL28的mRNA和蛋白比IRI-Alkbh5^fl/fl小鼠更丰富(图5a-c)。ELISA法也观察到血清中CCL28的类似变化(图5d)。然后用抗m6A抗体或IgG抗体进行MeRIP检测。与IgG抗体相比，抗m6A抗体的免疫沉淀导致Ccl28 mRNA水平高度富集(图5e)。这些结果表明m6A修饰参与了ALKBH5对Ccl28 mRNA的调控。为了确定ALKBH5和Ccl28 mRNA是否存在直接相互作用，我们使用腺病毒标记的ALKBH5载体(Ad-ALKBH5)进行了RNA-IP。与IgG抗体相比，抗Flag抗体组的免疫沉淀显示Ccl28 mRNA水平更高(图5f)。ALKBH5过表达会降低pGL3-CDS的荧光素酶活性，但不会降低pGL3-5'UTR或pGL3-3'UTR的荧光素酶活性(图5g)。ALKBH5过表达降低pGL3-CCL28-WT和pGL3-CCL28-Mut1,2,3,的荧光素酶活性，但不影响pGL3-CCL28-Mut4(图5h)。这表明Ccl28 mRNA上潜在的m6A位点(Mut4)是Alkbh5介导的去甲基化位点。
       先前的研究报道了ALKBH5通过m6A去甲基化破坏了mRNA的稳定性，因此我们假设ALKBH5缺乏稳定了Ccl28 mRNA。在通过actinomycin D抑制RNA聚合酶后的0、2、4和6小时检测mRTECs中Ccl28 mRNA的水平。RT-qPCR结果显示，敲低ALKBH5后，Ccl28的半衰期延长，表明ALKBH5的降低稳定了Ccl28 mRNA(图5i)。IGF2BPs是m6A读取器，具有增强mRNA稳定性的作用。因此，我们检测IGF2BPs (IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3)是否参与Ccl28 mRNA稳定性的调控。当IGF2BP2被敲除时，Ccl28 mRNA的表达明显抑制。但IGF2BP1或IGF2BP3的敲低作用有限(图5j)。WB分析还表明，IGF2BP2敲低抑制CCL28蛋白丰度(图5k)。使用抗IGF2BP2抗体的RNA免疫沉淀(RIP)分析进一步证实了H/R mRTECs中IGF2BP2和Ccl28 mRNA之间的相互作用(图51)。RNA稳定性分析显示，IGF2BP2敲低逆转了ALKBH5敲低对Ccl28 mRNA的稳定性增强作用(图5m)。因此，我们确定IGF2BP2是调控Ccl28mRNA稳定性的阅读蛋白。

6）Alkbh5缺乏增加了CCL28介导的Treg募集
       为了确定CCL28在AKI中的功能，我们检测了IRI后不同时间点肾组织中CCL28的表达水平。结果显示，Ccl28在IRI后表达增加，并在120 h达到峰值(图6a)。接着，我们检测了IRI后不同时间点肾脏组织中Tregs的浸润情况。Treg的数量变化与Ccl28的表达一致(图6b-d)。随着Alkbh5的降低，Ccl28和Tregs的水平升高(图6e)。我们假设Treg的募集参与了Alkbh5缺乏和CCL28上调在IRI中诱导保护作用的机制。我们比较了不同组在IRI后24 h肾组织中Tregs的百分比。IRI-Alkbh5^fl/flKsp^Cre组Tregs的浸润量明显高于IRI-Alkbh5^fl/fl组(图6f、g)。为了进一步探索CCL28是否确实是募集Treg的关键因素，我们给不同组的小鼠注射了抗CCL28抗体(图6h)。在抗CCL28抗体治疗后，IRI后Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠的Tregs百分比与未治疗的Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠相比显著降低(图6i, j)。然后，我们使用体外transwell实验测试了对新分离的小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)的趋化活性。在H/R + Ad-sh-ALKBH5组中，CCL28水平显著升高，而在H/R + Ad-sh-ALKBH5+抗CCL28组中，CCL28水平被抗CCL28抗体逆转(图6k)。我们观察到，H/R+Ad-sh-ALKBH5组CD4+细胞中Foxp3+CD4+细胞的百分比增加，CCL28抗体给药后Foxp3+CD4+细胞的百分比显著下降(图61,m)。

7）在I/R诱导的AKI中，CCL28/Treg/炎症细胞轴参与了Alkbh5缺乏治疗效果的机制
       先前的一项研究报道，Tregs抑制肾IRI中的中性粒细胞、巨噬细胞和先天免疫系统。我们结果表明，与Alkbh5^fl/fl小鼠相比，Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠IRI肾组织中Ly6G⁺中性粒细胞和F4/80⁺巨噬细胞较少(图7a)。为了证明CCL28/Treg/炎症细胞轴的功能，我们将CCL28和CD25抗体分别给予Alkbh5^fl/flKsp^Cre或Alkbh5^fl/fl小鼠。针对Ly6G和F4/80的免疫组化染色显示，与未给药CCL28或CD25抗体的小鼠相比，给药CCL28或CD25抗体显著增加了Alkbh5^fl/flKsp^Cre小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞数量(图7a)。肾功能和病理分析显示，CCL28或CD25抗体治疗逆转了Alkbh5缺乏的保护作用(图7b-e)。综上所述，CCL28和Treg阻断有效抑制了Alkbh5基因敲除的保护作用。CCL28/Treg/炎症细胞轴是ALKBH5在IRI中的直接下游靶点。

8）ALKBH5抑制剂IOX1和重组小鼠CCL28在IRI中发挥保护作用
       先前的研究发现IOX1是ALKBH5的抑制剂。我们在IRI模型中测试了IOX1和CCL28的作用(图8a)。IOX1有效地增加了m6A甲基化，但在Ccl28治疗的IRI组中没有观察到显著差异(图8b)。IOX1或CCL28处理可降低I/R后血清肌酐和BUN浓度(图8c、d)。H&E染色数据表明，IOX1或CCL28处理可减轻I/R诱导的肾损伤(图8e、f)。接下来，我们检测肾组织中Treg、中性粒细胞和巨噬细胞的百分比。在IOX1和CCL28治疗组中发现Treg募集增加(图8g, h)。相应地，与未治疗的IRI小鼠相比，IOX1或CCL28治疗组中性粒细胞和巨噬细胞数量减少(图8i)。

结论
       我们的研究表明，Alkbh5缺乏通过增加CCL28 mRNA m6A甲基化来上调CCL28的水平，从而增加CCL28 mRNA的稳定性。通过增加CCL28水平募集Treg，保护肾脏免受炎症细胞浸润的抑制。我们的工作将丰富目前对AKI中m6A甲基化和ALKBH5分子机制知之甚少的知识。我们还发现了ALKBH5/CCL28/Treg轴在I/R诱导的AKI中的调控作用。总的来说，我们的发现有望为治疗I/R诱导的AKI提供一种潜在的策略。

实验方法
腺病毒(Ad)转导，小鼠肾IRI模型构建，Masson’s trichrome染色，Sirius Red染色，RT-qPCR，Western blot，PAS染色，HE染色，免疫组化，免疫荧光，流式，ELISA，m6A点印记，Transwell，双荧光素酶报告实验，MeRIP，RIP，MeRIP-seq，RNA-seq。
参考文献
Chen J, Xu C, Yang K, Gao R, Cao Y, Liang L, Chen S, Xu S, Rong R, Wang J, Zhu T. Inhibition of ALKBH5 attenuates I/R-induced renal injury in male mice by promoting Ccl28 m6A modification and increasing Treg recruitment. Nat Commun. 2023 Mar 1;14(1):1161. doi: 10.1038/s41467-023-36747-y.