miR-92a-1-5p富集的前列腺癌细胞外囊泡调节破骨细胞功能

       我们之前报道过，来自成骨细胞、破骨细胞和混合前列腺癌细胞的细胞外囊泡(EVs)通过转移miR-92a-1-5p促进破骨细胞分化，抑制成骨细胞分化。在本研究中，我们专注于将miR-92a-1-5p工程化到EVs中，并确定工程化EVs的任何治疗作用和机制。qPCR证实，miRNA-92a-5p稳定过表达的细胞与EV上调该microRNA相关。此外，miR-92a-1-5p富集的EVs通过降低MAPK1和FoxO1的表达来促进体外破骨细胞分化，通过TRAP染色和破骨细胞功能基因mRNA表达显示，这与破骨细胞功能增加有关。靶向MAPK1或FoxO1的siRNA导致类似的破骨细胞功能增加。在体内，通过静脉注射给予miR-92a-1-5p富集的EVs促进骨溶解，这与骨髓中MAPK1和FoxO1表达的降低有关。这些实验表明，miR-92a-1-5p富集的EVs通过减少MAPK1和FoxO1来调节破骨细胞的功能。本文于2023年6月发表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.3）上。
技术路线

结果
1）miR‑92a‑1‑5p富集的EVs的产生
       通过慢病毒载体（pHBLV-U6-miR-92a-1-5pEF1-fLUC-T2A-Pro）转染，miR-92a-1.5p在MDA PCa 2b细胞中稳定过表达。通过qPCR证实miR-92a1-5p过表达约为两倍（图1A）。为了收集miR-92a-1-5p富集的EVs，将稳定表达的细胞在贫化培养基中培养48小时。来自EVs的总RNA显示miR-92a-1.5p增加了两倍（图1B）。接下来，将miR-92a-1-5p+EVs添加到Raw264.7细胞的培养基中，并在共培养后90分钟内观察到它们的快速内化（图1C）。在这种情况下，成熟miR-92a-1-5p的表达在24小时和48小时增加（图1D），而pre-miR-92a-1.5p的水平没有变化（图1E）。这些结果表明，表达的增加是由于成熟的miR-92a-1-5p通过miR-92a-1.5p+EVs的转移。

2）富含miR-92a-1-5p的EVs促进破骨细胞分化
       我们之前的研究报告称，前列腺癌EVs可以促进破骨细胞分化和减弱成骨细胞分化，两者至少部分通过转移miR-92a-1-5p介导。在这里，我们打算研究miR-92a-1-5p+EVs在骨稳态中的作用。在不存在RANKL的情况下，将Raw264.7细胞与对照EVs或miR92a-1-5p+EVs孵育24和48小时，然后进行qPCR分析，结果显示miR-92a-1-5p+EVs显著诱导了细胞中Ctsk和Trap的mRNA表达（图2A-B）。此外，在不存在RANKL的情况下，共培养6天后，通过Trap染色，miR-92a-1-5p+EVs在Raw264.7细胞和骨髓巨噬细胞（BMM）中显著促进破骨细胞分化（图2C-D）。

3）MAPK1是miR‑92a‑1‑5p的直接靶标
       为了阐明上述作用的分子机制，我们通过生信分析确定miR-92a1-5p的靶基因是MAPK1。qPCR分析显示，当miR-92a-1-5p过表达时，Raw264.7细胞中的MAPK1 mRNA表达显著降低（图3A），并且蛋白质印迹结果显示，在Lv-92a-1-5p处理的Raw264-7细胞中，MAPK1的水平降低，而不是磷酸化的MAPK1（pMAPK1）的水平降低（图3B）。通过使用免疫标记进一步证实了这些结果（图3C）。通过计算机分析，我们发现MAPK1 3′-UTR区域包含miR-92a-1-5p的匹配位点（图3D）。使用双荧光素酶报告基因分析，我们发现miR-92a-1-5p共转染的MAPK1 wt组的酶活性显著较低（图3E）。这一结果表明miR-92a-1-5p直接靶向MAPK1。

4）MAPK1下调促进破骨细胞分化
       为了阐明MAPK1下调如何影响破骨细胞分化，我们将MAPK1 siRNA转染到Raw264.7细胞中，并使用qPCR证实MAPK1表达降低（图4A）。值得注意的是，用Mapk1 siRNA转染Raw264.7细胞上调了Ctsk和Trap mRNA的表达（图4B-C），并在RANKL存在的情况下增加了Trap+破骨细胞（图4D-E）。此外，在RANKL存在的情况下，通过用Mapk1 siRNA转染后6天的免疫标记证实了Ctsk和Trap水平的增加（图4F-G）。

5）FoxO1抑制在MAPK1下调促进破骨细胞分化中的潜在作用
       在过表达Lv-92a-1-5p的Raw264.7细胞中，我们还无意中通过蛋白质印迹发现FoxO1下调（图5A）。然而，在使用TargetScan进行的生物信息学分析中，FoxO1未被鉴定为miR-92a-1-5p的潜在靶标。因此，我们构建了FoxO1 siRNA，以确定FoxO1是否在破骨细胞分化中发挥作用。尽管用Mapk1 siRNA转染后FoxO1 mRNA表达降低（图5B），但Mapk1 mRNA表达不受FoxO1 siRNA的影响，这表明FoxO1可能是破骨细胞分化中Mapk1的下游分子。在Raw264.7细胞中，用FoxO1 siRNA转染上调了Ctsk和Trap mRNA的表达（图5C-D），并增加了Trap+破骨细胞（图5E-F）。此外，通过免疫标记证实了Ctsk和Trap水平的增加（图5G-H）。Mapk1和FoxO1 siRNA诱导的破骨细胞分化也通过测量Trap活性得到证实（图5I）。接下来，我们研究了Mapk1 siRNA介导的破骨细胞分化是否依赖于FoxO1。无论FoxO1融合蛋白存在与否，破骨细胞的分化都得到促进（图5J）。这一发现表明，尽管FoxO1的表达在对Mapk1 siRNA的反应中被抑制，并且FoxO1下调影响破骨细胞分化，FoxO1对于由Mapk1 siRNA诱导的破骨细胞的分化不是必需的。

6）富含miR-92a-1-5p的EVs在体内促进骨溶解
       最后，我们研究了miR-92a-1-5p+EVs在体内的作用（图6A）。微计算机断层扫描（micro-CT）的结果显示，miR-92a-1-5p EVs组每骨体积骨表面积(BS/BV)增加，小梁厚度(Tb.Th)减少，两者均表明骨中存在骨溶解（图6B-C）。此外，Trap染色显示miR-92a-1-5p+EVs组中破骨细胞增加（6图D），同时MAPK1和FoxO1减少（图6E-F）。

结论
       总之，我们报道了一种富含miRNA的EVs构建系统，以构建富含miR-92a-1-5p的PCa-EVs亚群。进一步，我们阐明了这种设计的EVs在骨溶解中的作用和机制：富含miR-92a-1-5p的PCa EVs通过MAPK1和FoxO1介导破骨细胞分化，这可能有利于未来成骨细胞性骨病的治疗。

实验方法
细胞外囊泡分离，WB，qPCR，荧光素酶报告试验，动物研究，Micro‑CT。
参考文献
Yu L, Sui B, Zhang X, Liu J, Hao X, Zheng L. miR-92a-1-5p enriched prostate cancer extracellular vesicles regulate osteoclast function via MAPK1 and FoxO1. J Exp Clin Cancer Res. 2023 May 2;42(1):109. doi: 10.1186/s13046-023-02685-2.