国自然热点之一tsRNA——5′-tiRNA-Gln控制肝细胞癌发展

       tRNA衍生的小RNA（tsRNA）是新型的非编码RNA，参与各种疾病的发生和发展。然而，它们在肝细胞癌（HCC）中的确切存在和功能仍不清楚。本研究中，对HCC中差异表达的tsRNA进行分析。发现一种新的tsRNA，tRNA Gln-TTG衍生的5′-tiRNA-Gln明显下调，其表达水平与患者的病情发展相关联。5′-tiRNA-Gln通过结合真核启动因子4A-I（EIF4A1）发挥其功能，导致翻译受到部分抑制，控制HCC的发展。该研究于2023年3月发表在《Frontiers of Medicine》，IF：8.1。 
技术路线

主要研究结果
1. HCC和正常组织中tsRNA特征普分析
       为了确定特定的tsRNA在原发性HCC中的表达，作者通过RNA-PAGE分析4对肿瘤和邻近的非肿瘤肝组织tiRNA的水平。HCC组织的总tiRNA低于邻近组织（图1A）。通过高通量测序对这些样本的小RNA转录组进行分析。结果显示，无论在肿瘤还是邻近的非肿瘤组织中，reads数都在20-24 nt和31-33 nt富集（图1B）。miRNA占总reads数的绝大部分，其次是tsRNA和前体tRNA（图1C）。肿瘤组织中有77个tsRNA，非肿瘤组织中有67个tsRNA，共有tsRNA 有208个（图1D）。无论是在肿瘤还是邻近的非肿瘤组织中，5-tRF所占比例最高，其次是3-tRF和5′-tiRNA（图1E和1F）。

图1. HCC组织中的小ncRNA概况

2. 5′-tiRNA-Gln在肿瘤组织中下调，负向调节HCC转移和肿瘤大小
       对差异表达的tsRNA进行分析，总共发现80个上调的和74个下调的tsRNA（图2A）。其中包括19个tiRNA（图2B），只有5′-tiRNA-Gln的表达与数据库中一致。通过RT-qPCR在76个HCC组织对中验证了5′-tiRNA-Gln的表达水平。结果显示，与差异分析结果一致，5′-tiRNA-Gln在肿瘤组织中明显下调，表明具有肿瘤抑制作用（图2C）。Northern blot实验也得到了类似的结果（图2D）。作者还发现，转移组的5′-tiRNA- Gln的相对平均水平明显低于非转移组（图2E）。且5′-tiRNA-Gln表达水平的降低与大肿瘤呈正相关（图2F）。这些结果表明，5′-tiRNA-Gln在HCC中明显下调，在HCC转移和肿瘤大小中起着负向调节作用。

图2. 5′-tiRNA -Gln在HCC组织中下调并与HCC进展有关

3. 过表达5′-tiRNA-Gln抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭
       5′-tiRNA-Gln mimics转染24小时后，分析它对HCC细胞生长、迁移和侵袭的影响。CCK-8实验显示，5′-tiRNA-Gln mimics降低细胞的活力（图3A）。Transwell实验显示，5′-tiRNA-Gln mimics的过表达降低了Huh-7细胞的迁移和侵袭能力（图3B）。siRNA进行功能缺失实验，之后对细胞活力、迁移和侵袭进行研究（图3C和3D），结果表明，5′-tiRNA-Gln的敲除增强SK-Hep-1细胞的生存能力、迁移和侵袭。将稳定转染5′-tiRNA-Gln或对照RNA的Huh-7细胞皮下注射到裸鼠体内，6周后，与对照组相比，5′-tiRNA-Gln肿瘤重量更少（图3E）。菌落形成实验也得到类似的结果（图3F）。这些结果表明，过表达5′-tiRNA-Gln抑制HCC细胞的活力。

图3. 5′-tiRNA-Gln可抑制HCC细胞在体外和体内的增殖、迁移和侵袭。

4. 5′-tiRNA-Gln与EIF4A1选择性互作
       将生物素标记的5′-tiRNA-Gln转染到Huh-7细胞中48小时，MS鉴定出84个特异性结合的蛋白质。根据蛋白质的得分，EIF4A1被选为候选人（图4A），它是翻译启动过程中的一个关键酶。根据GEPIA生存曲线分析，HCC中较高的EIF4A1表达水平意味着较低的生存率（图4B），表明其具有肿瘤蛋白作用。RNA pull-down实验证明，EIF4A1与5′-tiRNA- Gln有更强的结合力（图4C）。RIP实验证实，5′-tiRNA-Gln在EIF4A1免疫沉淀物中明显富集（图4D）。RNA FISH和免疫荧光检测显示，5′-tiRNA-Gln和EIF4A1在细胞质中发生共定位（图4E）。因此，作者推断5′-tiRNA-Gln通过与细胞质中的EIF4A1相互作用来抑制HCC肿瘤发展。

图4. 5′-tiRNA-Gln与EIF4A1选择性互作

5. 5′-tiRNA-Gln过表达抑制翻译
       通过嘌呤霉素捕获，确定新生蛋白合成水平（图5A），验证5′-tiRNA-Gln对EIF4A1功能的影响。结果显示，5′-tiRNA-Gln抑制蛋白质的合成率。COG/KOG功能分类分析表明，下调的蛋白主要与转录和翻译、核糖体结构和生物生成过程有关（图5C）。对下调蛋白的KEGG分析显示，乙型肝炎、MAPK信号传导、丙型肝炎和癌症的途径发生显著变化（图5D）。Western blot表明，通过过表达5′-tiRNA-Gln和下游的磷酸化蛋白（p-ERK1/2和p- STAT3），ARAF、MEK1/2和STAT3的表达被下调。然而，在BID的表达中没有观察到明显的差异（图5E）。这些结果表明，5′-tiRNA-Gln的过量表达直接针对EIF4A1的功能，而不是其表达水平，从而抑制了EIF4A1相关翻译。

图5. 5′-tiRNA-Gln在Huh-7细胞中抑制翻译

6. G-四链体结构是5′-tiRNA-Gln的必要条件
       根据QGRS Mapper构建了没有能力形成G-四联体的突变体5′-tiRNA-Gln。通过过表达突变体5′-tiRNA-Gln，研究了Huh-7细胞的活力、迁移和侵袭能力（图6A和6B）。突变体与5′-tiRNA-Gln有明显差异。RNA pull-down实验表明突变体5′-tiRNA-Gln未能特异性地下拉EIF4A1（图6C）。接下来测定了多聚核糖体的情况，结果显示，与突变体相比，5′-tiRNA-Gln减少了mRNA与多聚核糖体的结合（图6D）。进一步， 检测了ARAF、MEK1/2和STAT3的表达。ARAF、MEK1/2和STAT3的mRNA没有明显差异（图6E），而与突变体相比，过表达5′-tiRNA-Gln明显降低了它们与EIF4A1的mRNA（图6F）和蛋白质结合水平（图6G）。这些结果表明，5′-tiRNA-Gln形成G-四链体的潜力，是其调节EIF4A1介导的翻译和抑制HCC进展的必要条件。

图6. 突变的5′-tiRNA-Gln失去了抑制Huh-7细胞活力的功能

7. HCC肿瘤中5′-tiRNA-Gln的表达水平与ARAF、MEK1/2或STAT3的免疫表达负相关
       IHC染色和Spearman相关性分析显示，HCC组织中5′-tiRNA-Gln和ARAF、MEK1/2或STAT3的表达水平有明显的负相关（图7A）。图7B为5′-tiRNA-Gln在HCC进展中的作用示意图。

图7. HCC组织中5′-tiRNA-Gln与ARAF、MEK1/2和STAT3的表达呈负相关

结论
       综上所述，该研究分析了HCC中差异表达的tsRNA，并发现了一种新的tiRNA，即5′-tiRNA-Gln，它是一种肿瘤抑制因子。5′-tiRNA-Gln与EIF4A1相互作用，通过分子内G-四链体结构负向调节相关蛋白的翻译，抑制了HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

实验方法
RNA-PAGE，RT-qPCR，Northern blot，siRNA干扰，Transwell，裸鼠成瘤，菌落实验，RNA pull-down，RIP，RNA FISH，Western blot，多聚核糖体分析，质谱分析，IHC染色
参考文献
Wu C, Liu D, Zhang L, Wang J, Ding Y, Sun Z, Wang W. 5'-tiRNA-Gln inhibits hepatocellular carcinoma progression by repressing translation through the interaction with eukaryotic initiation factor 4A-I. Front Med. 2023 Mar 28. doi: 10.1007/s11684-022-0966-6. Epub ahead of print. PMID: 36973570.