7张图揭示泛素化在癌症中突变型p53积累和功能性获得中的新角色

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       ‍突变型p53（mutp53）蛋白通常在人类癌症中积累到非常高的水平，以通过功能获得（GOF）机制促进癌症进展。目前，mutp53积累和GOF的潜在机制尚未完全了解。TRIM21作为mutp53的一个关键的E3泛素连接酶，mutp53通过筛选特定的mutp53相互作用的蛋白质。本研究通过CO-IP和LC-MS/MS实验确定了TRIM21直接靶向结合mutp53，且TRIM21能够通过影响mutp53的泛素化负性调控mutp53的表达，抑制癌细胞的锚定非依赖性生长，并且能够抑制原位和皮下瘤的生长，TRIM21的低表达了也逆转了mutp3介导的癌症的不良预后。本文章于2023年3月发表在《Journal Clinical Investigation》上，IF=15.9‍

技术路线

主要研究内容

1.TRIM21是mutp53相互作用的蛋白

       ‍在表达异位热点R175H mutp53或wtp 53的人结直肠癌p53^−/− RKO细胞中使用co-IP与p53抗体筛选特异性mutp53相互作用蛋白，然后进行LC-MS/MS分析。TRIM21被鉴定为优先结合R175H mutp53但不结合wtp 53的潜在蛋白质。R175H、G245S、R248Q和R273H热点mutp53已显示出GOF活性并广泛用于mutp 53 GOF研究。因此，在表达异位TRIM21-Flag和mutp53的p53^-/-RKO细胞中，使用co-IP，随后进行Western印迹分析，研究了TRIM21和这四个热点GOF mutp53之间的相互作用（图1A）。在p53^+/+ RKO细胞中没有观察到内源性TRIM21和wtp53之间的明显相互作用（图1B），但观察到内源性TRIM21和不同mutp53之间的相互作用（图1C和D）。为了确定TRIM21-mutp53相互作用所需的TRIM21结构域，构建表达TRIM21-Flag系列缺失突变体的载体（图1 E），并与R175H mutp53载体共转染到p53^-/-RKO细胞中用于共IP测定。结果显示SPRY和PRY结构域是TRIM21与R175H mutp53相互作用的重要位点（图1 E）。同时，R175H mutp53的DBD结构域是R175H mutp53与TRIM21相互作用的位点（图1F）。使用重组GST-TRIM21和His-mutp53或His-wtp53蛋白的体外谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验显示，TRIM21在体外直接与mutp53相互作用，但不与wtp53相互作用（图1H）。此外，SPRY和PRY结构域的缺失消除了GST-TRIM21在体外与His-mutp53直接相互作用的能力（图1H）。总之，这些结果表明TRIM21直接且特异性地与细胞中的mutp53相互作用。‍

图1：TRIM21是一种特定的mutp53结合蛋白

2.TRIM21抑制了mutp53在癌症细胞中的积累

       ‍通过对TRIM 21稳定敲低检测癌细胞中的mutp53蛋白水平，发现TRIM 21-Flag的异位表达显著下调SK-BR3、HT29、LS1034和HCC70细胞中不同内源mutp53蛋白的水平，而wtp53蛋白的表达水平并无明显改变（图2A）。此外，TRIM21-KO分别明显增加SK-BR3和HT29细胞中R175H和R273H mutp53的蛋白质水平（图2B）。类似地，通过不同shRNA载体的TRIM21敲低分别明显增加了LS1034和HCC70细胞中的G245S和R248Q mutp53蛋白水平，但对MCF 7和p53^+/+ RKO细胞中的wtp53蛋白水平影响较小（图2C）。通过将R172H mutp53敲入小鼠，提取源自TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），发现TRIM21^-/-p53^R172H/R172H MEF显示出比TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H MEF高得多的mutp53蛋白水平（图2D）。然而，在TRIM21^+/+ p53^+/+和TRIM 21^-/- p53^+/+ MEF之间没有观察到wtp53蛋白水平的明显差异（图2D）。RT-qPCR测定的结果显示，TRIM21没有明显影响上述细胞系中mutp53或wtp53的mRNA水平（图2E-H）。这些结果表明，TRIM21优先下调mutp53而不是wtp53的蛋白水平，并且TRIM21缺陷导致mutp53在癌细胞中积累。‍

图2：TRIM21抑制了mutp53在癌症细胞中的表达

3.TRIM21促进mutp53的泛素化和降解

       用表达R175H或R273H mutp53的载体连同表达WT TRIM21-Flag或缺失RING结构域（ΔRING）的突变TRIM21-Flag的载体共转染p53^-/-RKO细胞。发现WT而非ΔRING TRIM21-Flag明显下调p53^−/− RKO细胞中的外源mutp53蛋白水平，而用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后这种变化又被消除（图3A和B）。为了研究TRIM21是否泛素化mutp53，在不同细胞中进行体内泛素化测定。WT而非ΔRING TRIM21-Flag的异位表达显著促进了p53^−/− RKO细胞中外源R175H和R273H mutp53的泛素化（图3C）。此外，TRIM21 KO分别降低SK-BR3和HT29细胞中内源性R175H和R273H mutp53的泛素化（图3D）。TRIM 21介导的mutp53泛素化通过使用重组蛋白的体外泛素化测定进一步证实; WT GST-TRIM 21诱导His-mutp53的泛素化，但不诱导Hiswtp53的泛素化，其通过TRIM21 RING结构域的缺失而消除（图3E）。验证TRIM21是否使mutp53不稳定，在内源性R175H mutp53蛋白水平的蛋白质印迹分析之前，用蛋白质合成抑制剂环己酰胺（CHX）处理具有TRIM 21-Flag表达或TRIM21 KO的SK-BR3细胞及其对照细胞不同的时间段。R175H mutp53蛋白的半衰期通过TRIM21-Flag的异位表达而明显降低（图3F），并且通过TRIM21 KO而增加（图3G）。这些结果表明TRIM21直接结合mutp53以泛素化和降解mutp53，并且TRIM21缺陷导致mutp53稳定和积累。

图3：TRIM21通过泛素化促进mutp53蛋白的降解

4.TRIM21抑制mutp53积累以抑制癌细胞的锚定非依赖性生长

       ‍验证TRIM21是否影响mutp53 GOF活性，促进锚定非依赖性细胞生长。发现癌细胞中mutp53的敲低显著抑制了锚定非依赖性细胞生长，mutp53在癌细胞中的GOF活性（图4A和B）。癌细胞中的TRIM21 KO显著促进非贴壁依赖性细胞生长，但这种效应在很大程度上被mutp53 KO消除（图4A和B）。异位TRIM 21-Flag表达显著抑制细胞的贴壁非依赖性生长，但对其相应的mutp53 KO细胞中抑制作用减弱（图4C）。转化的MEFs的锚定非依赖性生长被wtp53显著抑制（p53 ^+/+ vs p53^-/-），但被R172H mutp53促进（p53^R172H/R172H vs p53^-/-）。另外，TRIM21缺失显著促进p53^R172H/R172H MEFs的锚定非依赖性生长，但不促进p53 ^+/+或p53^−/− MEFs的锚定非依赖性生长（图4D）。这些结果共同表明，TRIM21通过抑制mutp53积累和GOF来抑制贴壁非依赖性细胞生长。‍

图4：TRIM21抑制mutp53 GOF，促进癌细胞的非锚定生长

5.TRIM21抑制mutp53积累以抑制原位和皮下肿瘤的生长

      ‍ 通过SKBR3细胞构建的原位乳腺肿瘤和在无胸腺裸鼠中皮下注射HT29细胞形成的结肠直肠异种移植肿瘤，SK-BR3细胞中的TRIM21 KO显著促进SK-BR3原位肿瘤的生长，而R175H mutp53 KO显著抑制肿瘤生长并在很大程度上消除了TRIM21 KO对肿瘤生长的促进作用（图5A）。SK-BR3肿瘤组织的蛋白质印迹分析和IHC染色显示TRIM21 KO明显增强mutp53蛋白水平（图5B和C）。同样，HT29细胞中的TRIM21 KO显著促进肿瘤生长并明显增加肿瘤中mutp53蛋白水平，但HT29细胞中的mutp53 KO显著抑制肿瘤生长并在很大程度上消除了TRIM21 KO对肿瘤生长的促进作用（图5D和E）。另外，TRIM21-Flag表达大大降低了SK-BR3和HT29肿瘤中的mutp53水平（图5G和I）。这些结果共同证明了TRIM21抑制mutp53积累以抑制mutp53 G0F促进肿瘤生长。‍

图5：TRIM21抑制mutp53积累促进肿瘤生长

6.TRIM21的低表达校正mutp53癌症中的不良预后

       组织芯片的结果显示，TRIM21的表达在两个不同的结肠直肠癌组中，分别有63%（n=57/90）和44%（n=22/50）的结肠直肠癌下调（图6A），在50%（n=20/40）的乳腺癌中下调（图6 B）。此外，与其匹配的相邻非肿瘤组织相比，结直肠癌和乳腺癌中TRIM21的平均蛋白水平显著降低（图6A和B）。同样，与非肿瘤乳腺组织相比，TRIM21蛋白水平在这些乳腺癌中显著下调（图6C）。TCGA数据库中的TRIM21表达的分析显示，几种类型的肿瘤中的低TRIM21表达与患有mutp53癌症而非wtp53癌症的患者中的不良临床结果显著相关（图6D）。这些结果表明TRIM21在一些携带mutp53的癌症中的肿瘤抑制功能。

图6：TRIM21的低表达校正mutp53癌症中的不良预后

7.TRIM21缺失导致mutp53在正常组织中积累并促进p53^R172H/R172H小鼠的肿瘤发生

       ‍构建TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠，发现TRIM21缺失没有明显影响p53^-/-或p53^+/+小鼠的寿命，但TRIM21缺失导致肿瘤发病更早，这显著降低了p53^R172H/R172H小鼠的寿命。TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53 ^R172H/R172H小鼠的中位生存期分别为157天和134天（p=0.0002；图7A）。在p53 ^{R172 H/R172H}小鼠的正常组织（包括脾、胸腺、小肠和结肠组织）中未观察到mutp53蓄积，通过Western印迹和IHC分析，在TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的这些正常组织中mutp53蛋白蓄积至高水平（图7B和C）。而在正常（非应激）条件下，wtp53蛋白水平在正常组织中保持在非常低的水平（图7D）。尽管mutp53在TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的肿瘤中积累，但与TRIM 21^+/+ p53^R172H/R172H肿瘤相比，在TRIM21^-/-p53^R172H/R172H肿瘤中观察到更高水平的mutp53积累（图7 E）。通过co-IP测定证实了肿瘤中TRIM21和R172H mutp53蛋白之间的相互作用，表明TRIM21与mutp53在体内相互作用（图7 F）。总之，这些结果表明TRIM 21缺失导致mutp53在正常组织中积累，并且mutp53在肿瘤中进一步积累，导致p53^R172H/R172H小鼠的更早的肿瘤发作和寿命缩短。‍

图7：TRIM21缺失导致mutp53积累并促进p53^R172H/R172H小鼠的肿瘤发生

结论
       ‍总之，这个研究揭示了癌症中mutp53积累和GOF的关键机制，并且还鉴定了TRIM21在癌症中的肿瘤抑制功能的重要机制。更好地理解肿瘤中mutp53积累和GOF的机制将为开发针对携带mutp53的癌症的有效治疗策略提供新的机会。
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实验方法
细胞培养和载体构建，CRISPR/Cas9构建 KO细胞系，LC-MS/MS测定，western blot，免疫共沉淀实验，GST pull-down，RT-qPCR，泛素化测定，半衰期分析，锚定非依赖性生长测定，小鼠成瘤实验，免疫组化，TCGA数据库分析。
参考文献：
Liu, J., Zhang, C., Xu, D., Zhang, T., Chang, C. Y., Wang, J., Liu, J., Zhang, L., Haffty, B. G., Zong, W. X., Hu, W., & Feng, Z. (2023). The ubiquitin ligase TRIM21 regulates mutant p53 accumulation and gain of function in cancer. The Journal of clinical investigation, 133(6), e164354. https://doi.org/10.1172/JCI164354

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