USP48的药理激活——USP48-GSDME轴促进癌细胞焦亡

       焦亡是一种细胞程序性死亡，其特征是炎症caspase的激活和Gasdermin蛋白的裂解。焦亡可以抑制肿瘤发展，诱导抗肿瘤免疫，激活焦亡是一种潜在的治疗癌症的策略。本研究中，作者通过CRISPR-Cas9筛选，发现USP48（一种去泛素化酶）的缺失显著抑制了细胞焦亡。USP48通过Gasdermin E （GSDME）促进焦亡。该研究于2023年4月发表在《Cancer Research》，IF：11.2。
技术路线

主要研究结果
1. USP48参与焦亡的调控
       显微镜下观察人宫颈癌HeLa细胞经raptinal处理后的形态学变化，发现HeLa细胞中出现焦亡的球囊细胞膜，证实raptinal可以诱导HeLa细胞焦亡（图lA）。在HeLa细胞中进行CRISPR-Cas9基因筛选，以raptinal处理后LDH的分泌量为读取值，并通过单siRNA筛选技术进一步筛选和验证获得的基因（图1B）。根据转染sgRNA后LDH分泌的倍数变化，选择36个基因作为主要基因。其中，17个候选基因的沉默使LDH的分泌增加2倍以上，而其他19个基因的沉默则抑制了LDH的分泌（图1C-D）。干扰USP48对细胞内LDH的释放有明显的抑制作用（图1E）。用raptinal处理细胞，检测USP48沉默对HeLa细胞LDH、IL-1β和IL-18的影响（图1F-H）。结果表明，USP48沉默可显著抑制HeLa细胞中LDH、IL-1β和IL-18的释放。通过延时显微镜观察转染USP48特异性siRNA （si-USP48）的HeLa细胞，结果显示USP48沉默显著抑制raptinal诱导的焦亡和SYTOX Green吸收（图1I-J）。USP48沉默抑制raptinal诱导的HMGB1释放（图1K）。综上所述，初步确认USP48可能参与焦亡调控。

图1. USP48参与焦亡的调控

2. USP48调控GSDM的表达
       检测6种不同人源性细胞系中USP48的表达，发现USP48在293T细胞中低表达，在HeLa细胞中高表达（图2A）。在293T细胞系中稳定过表达USP48，在HeLa细胞系中稳定敲低USP48（图2B）。将质谱和蛋白质组学结果结合分析，获得8个相关蛋白（图2D和E）。检测过表达USP48和敲低USP48后这8种蛋白的表达水平变化，发现GSDME相比其他几种蛋白的变化更为显著和稳定（图2F和G）。图2H进一步证实GSDME的表达与USP48的表达呈正相关，但GSDMD和USP48的表达状态不存在显著相关。催化失活突变体USP48 （USP48/C98A）的过表达不会影响GSDME的表达（图2I）。通过CO-IP进一步证实USP48与GSDME之间的相互作用（图2J-K）。此外，作者还发现USP48不影响GSDME的裂解（图2L）。综上，USP48可以调节GSDME的表达（但不影响其裂解），并且与GSDME有直接的相互作用。

图2. GSDME是USP48的下游靶蛋白

3. USP48通过调控GSDM的表达影响焦亡
       建立一个同时表达USP48和靶向GSDME的shRNA的293T细胞系（图3A）。GSDME的下调大大挽救了raptinal处理后293T细胞中USP48过表达对LDH（图3B）、IL-1B（图3C）和IL-18（图3D）的促进作用。相反，在同时表达shUSP48和GSDME的HeLa细胞系中（图3E），也证实了过表达GSDME可以恢复USP48敲低对293T细胞经raptinal处理后产生LDH（图3F）、IL-1β（图3G）和IL-18（图3H）的抑制作用。用延时显微镜观察表达USP48和shRNA靶向GSDME的293T细胞系经raptinal处理后SYTOX Green的形态和吸收情况，得到了一致的结果（图3I-J）。综上所述，证实USP48可能以不依赖于caspase-3的方式促进GSDME的表达，从而促进GSDME的表达发生焦亡。

图3. USP48通过GSDME调控焦亡

4. USP48通过去泛素化防止GSDME降解
       为进一步确认USP48是否会影响GSDME的稳定性，作者发现蛋白酶体特异性抑制剂MG132可以有效逆转USP48敲低对GSDME的影响（图4A），通过环已酰亚胺（CHX）追踪分析评价USP48调节GSDME蛋白肿瘤速率的潜力，结果表明USP48水平的降低与GSDME半衰期的缩短明显相关（图4B）。用Dox诱导的野生型USP48 （USP48/WT）和催化失活突变型USP4S （USP48/C98A）建立293T细胞，发现只有野生型USP48以Dox剂量依赖的方式逐渐增加GSDME水平（图4C），而表达USP48/C98A的细胞中未检测到GSDME蛋白水平的显著变化（图4D）。进一步的实验发现过表达野生型USP48显著降低GSDME的泛素化水平，而表达USP48/C98A的293T细胞对GSDME的泛素化没有影响（图4E）。相反，敲低USP48会导致泛素化GSDME的积累（图4F）。作者还发现USP48影响GSDME中K48连接的泛素，但对K63连接的泛素化没有影响（图4G）。体外泛素化实验表明，泛素K48在K30、K120和K189位点使GSDME泛素化 （图4H和I）。接下来，为鉴定USP48修饰的GSDME的靶残基，在GSDME的K30、K120和K189位点构建相应的点突变体（图4J），结果显示，USP48在K120处抑制GSDME的K48连锁泛素化（图4K）。综上所述，USP48通过抑制GSDME K120位点的K48连锁泛素化来阻止GSDME的降解。

图4. USP48通过去泛素化抑制GSDME的降解

5. USP48通过调节GSDME的表达影响抗肿瘤免疫
       为了进一步证明USP48的功能，建立USP48缺陷小鼠自发性胰腺肿瘤发生（KUC）模型。免疫组化和免疫荧光结果显示USP48的表达水平与GSDME的表达呈正相关（图5A-F）。此外，小鼠组织中USP48的缺失对GSDMD的表达也没有影响（图5G和H）。免疫荧光结果显示，KUC小鼠肿瘤浸润性CD8⁺和CD4⁺T细胞明显减少（图5I-J）。自然杀伤细胞和CD8⁺细胞毒性T杀伤细胞的比例明显降低，而肿瘤相关巨噬细胞和Treg细胞的比例则显著增加（图5K）。综上所述， USP48可以通过调节GSDME的表达来影响细胞的抗肿瘤免疫。

图5. USP48参与抗肿瘤免疫的调节

6. 单细胞测序实验阐明USP48对抗肿瘤免疫的调控作用
       对KC和KUC小鼠的胰腺组织进行单细胞测序，所有细胞CD45基因（PTPRC）均呈阳性（图6A）。大小聚类算法显示KC和KUC小鼠胰腺肿瘤组织中的细胞分布（图6B）。将细胞分组，定义捕获TAM的5个细胞群，即树突状细胞（dc）、T细胞、单核细胞-1细胞和单核细胞-2细胞（图6C）。比较KC和KUC胰腺癌组织中细胞亚群的差异，发现USP48表达的下调显著增加了TAM和单核细-2的数量（图6D）。通过热图和点阵图 （图6E和F），得到KC和KUC胰腺癌组织中各细胞亚组的数量和比例（图6G）。对KC和KUC胰腺癌组织中的T细胞进行亚群分析（图7A）。结果发现， Tex细胞和Treg细胞在KUC胰腺癌组织中的比例显著增加，表明USP48表达的降低抑制肿瘤免疫的发生（图7B）。使用UMAP显示T细胞亚群分类标准标记基因的表达以及T细胞亚群在KC和KUC胰腺癌组织中的比例，进一步证实上述结果（图7C-D）。使用多色免疫荧光实验检测KC和KUC小鼠胰腺癌组织中Tex细胞和Treg细胞的分布，得到的结果与测序结果一致（图7E和F）。敲低USP48显著增加TAM亚群的比例（图7G和H）。多色免疫荧光实验证实USP48的缺失增加TAM在胰腺癌组织中的分布（图7I）。综上所述， USP48缺失抑制胰腺癌细胞的抗肿瘤免疫。

图6. 胰腺癌中KC和KC；USP48^-/-CD45⁺细胞的单细胞分析

图7. 敲除USP48可增加浸润胰腺癌的去势T细胞、Treg和TAM的比例

7. USP48-GSDME调节小鼠对抗PD -1免疫治疗的敏感性
       将过表达USP48的Pan02细胞或空载体皮下植入C57/B6小鼠。在第7天、第11天和第15天用抗aPD-1处理小鼠，连续观察小鼠的生长情况，并在第30天处死小鼠（图8A）。结果表明，过表达USP48可显著抑制小鼠体内肿瘤的生长，而过表达USP48突变体（USP48/C98A）对小鼠体内肿瘤生长无抑制作用。过表达USP48也显著提高小鼠对抗PD -1治疗的敏感性（图8B-E）。在过表达USP48的Pan02细胞中表达shGSDME或scramble，并皮下注射到C57/B6小鼠体内。与预期结果一致，在USP48过表达的Pan02小鼠中，敲低GSDME的表达可有效逆转USP48过表达对肿瘤生长的抑制作用和促进抗PD -1治疗的敏感性（图8F-I）。对小鼠肿瘤进行流式细胞术检测，结果与之前的结果一致 （图8J-K）。这些结果进一步证实USP48-GSDME通路在抗肿瘤免疫中的重要作用，并发现其在肿瘤免疫治疗中的关键调控作用。

图8. USP48-GSDME影响小鼠对抗PD-1免疫疗法的敏感性

结论
       综上所述，本研究确定了USP48对焦亡的关键调控作用，并阐明了其分子机制以及USP48在抗肿瘤免疫和免疫治疗中的作用。因此，特异性靶向USP48或USP48-GSDME轴可能是未来潜在的治疗策略。

实验方法
细胞培养，逆转录病毒转染， CRISPR敲除，免疫组化，多重免疫荧光，WB，Co-IP，体外泛素化实验，qRT-PCR，流式细胞术，SYTOX green 染色，LDH检测，IL-18和IL-1β检测，RNA-seq文库构建，肿瘤异种移植。
参考文献
Ren Y, Feng M, Hao X, Liu X, Li J, Li P, Gao J, Qi Q, Du L, Wang C, Wang Q, Wang Y. USP48 Stabilizes Gasdermin E to Promote Pyroptosis in Cancer. Cancer Res. 2023 Apr 4;83（7）:1074-1093. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-22-1812. PMID: 36607699.