scRNA-seq揭示RCT诱导肿瘤生态系统重塑
放化疗（RCT）是一种治疗宫颈癌症的有效方法，它不仅影响恶性细胞，而且影响肿瘤免疫和基质细胞。在本研究中，作者将RCT前后的宫颈癌组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）,发现RCT后残留的上皮细胞上调MHC II类基因表达。此外，RCT过程中募集具有促炎性质的单核细胞样髓系抑制细胞（MDSCs）和高表达细胞毒性基因的CD16+ NK细胞。然而，RCT后细胞毒性T细没有显著增加。该研究于2023年1月发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF：39.3。
技术路线
主要研究结果
1. scRNA-seq鉴定RCT宫颈癌微环境动态变化
作者从2名宫颈上皮肿瘤患者中收集三份邻近正常宫颈组织样本用于scRNA-seq（图1a）。此外，作者还利用了由15个免疫组织化（IHC）验证的RCT前与RCT后宫颈癌样本构成的cohort 1，以及由20个RCT前与RCT后宫颈癌样本bulk RNA-seq数据构成的cohort 2（图1b）。作者富集免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞进行scRNA-seq。在这些细胞中，作者共注释出9种细胞簇：髓系细胞，T细胞，浆细胞，B细胞，DC细胞，内皮细胞，内皮细胞，血管成纤维细胞，以及基质成纤维细胞（图1c）。作者发现，RCT后上皮细胞显著降低，而髓系细胞明显升高（图1d）。
图1：RCT前后宫颈癌单细胞微观
2. 上皮细胞亚型之间存在不同的RCT敏感性和免疫原性
接下来，作者对上皮细胞进一步聚类，共产生五种亚群Epi1-5（图1e）。RCT改变了这五种上皮细胞亚群比例，最显著的是Epi2比例增加和Epi3比例减少（图1f，g）。然后，作者对RCT如何影响上皮细胞亚群的免疫反应进行研究。免疫相关最高差异表达基因（DEG）和GO数据显示，参与白细胞趋化、淋巴细胞活化、抗原呈递和处理基因表达增加（图2a–c）。RCT后，所有上皮细胞以及Epi1/4/5中显著上调抗原呈递和处理基因（包括MHC-II），虽然抗原处理和呈递通路在Epi2/3中保持相对稳定，但只有Epi2显示MHC-I表达下调（图2d，e）。患者样本中的特征基因表达也出现类似的变化：在多数患者中，观察到的基因表达变化与总体基因表达变化相对应。来自cohort 1样品的IHC染色也证实RCT后上皮细胞MHC-II基因表达上调（图2f，g）。
接下来，作者评估RCT如何影响上皮细胞亚群的恶性特征。与正常和RCT后样本相比，RCT前样本中G2/S期基因表达比例更高（图2h）。虽然3个上皮细胞亚群中非整倍体细胞（肿瘤细胞）比例在RCT后降为零，但在RCT 3周后检测到Epi2/3中仍然残留大量非整倍体细胞（图2i）。尽管残留的Epi2/3亚群在同时间点没有发生增殖（图2h），但Epi2高表达SPRR和S100A家族基因，它们是癌前期和癌转移标志。
图2：RCT激活上皮细胞免疫反应
3. RCT诱导髓系细胞促炎基因的表达
根据标记基因的表达，作者将髓系细胞分为七个亚群：三种巨噬细胞亚型、两种单核细胞来源的髓系抑制细胞（M-MDSCs）和两种DC群体（图3a）。髓系细胞可能同时包含促肿瘤和抗肿瘤的细胞亚群。为验证这一观点，作者量化促炎M1-和抗炎M2相关基因在巨噬细胞亚群中的表达，发现它们显示出M1和 M2综合特征（图3b）。髓系细胞组成在RCT后有所改变（图3c，d）： FCN1_M-MDSC相对比例显著增加，CD1C_DC相对比例下降。cohort 1中的IHC以及cohort 2中bulk RNA-seq数据也证实了FCN1_M-MDSC的富集。无论细胞亚群比例如何，RCT后所有亚群的促炎信号均有所增加（图3h）。GO结果显示，参与白细胞迁移和激活的基因在RCT后中M-MDSCs、巨噬细胞和DC中表达增加（图3i、j）。
与所报导的辐射募集MDSCs一致，作者观察到M-MDSCs趋化和迁移的富集时期（图3i），这可能有助于FCN1_MMDSC的增加（图3d）。此外，FCN1_M-MDSC亚群的促炎和抗炎特征分别显著上调和下调（图3h）。总而言之，RCT通过诱导髓系细胞中促炎基因表达和促进具有促炎上调和抗炎下调功能的FCN1_M-MDSCs募集，改变了宫颈癌的免疫平衡。
图3：RCT增加具有促炎特征的FCN1_M-MDSC细胞
4. RCT严重影响淋巴细胞.
淋巴细胞中NK和T细胞具有促肿瘤或抗肿瘤作用。作者检测到10个T细胞亚群和2个NK细胞亚群（图4a）。RCT后，CD16_NK细胞比例显著增加，而CD56_NK细胞比例保持不变（图4b，c）。cohort 1样本IHC验证了CD16_NK细胞的增加（图4d，e），cohort 2数据验证了CD16表达的变化（图4f）。NK细胞DEG和GO结果显示，RCT后，两个NK细胞亚群中与白细胞迁移相关基因以及CD16_NK细胞亚群中细胞毒性相关基因均有所增加（图4g、h）。CD16_N K细胞增强了RCT后GZMB、GZMH和NKG7的表达，主要在NK细胞毒性颗粒中表达（图4i）。同时，作者发现细胞毒性基因的表达与患者生存率呈正相关（图4j）。随着NK细胞组成发生变化，RCT后局部T细胞群也发生重组。其中，CD4_naive细胞显著增加，而Exhausted_CD8_T细胞显著降低（图4k）。尽管所有T细胞亚群中的抑制特征下调，但细胞毒性评分没有增加，这与NK细胞不同（图4l）。
图4：RCT增加具有细胞毒性特征的CD16_NK细胞丰度
5. RCT期间癌相关成纤维细胞减少促瘤特征基因表达
成纤维细胞影响肿瘤发展过程。作者鉴定成纤维细胞六个亚群：基质癌相关成纤维细胞（mCAF），炎性CAFs（iCAFs），抗原呈递CAFs（apCAFs），血管CAFs（vCAFs）（图5a）。作者比较了RCT前后CAF亚群特征。他们发现，iCAFs和一种apCAFs（以下称为apCAF2）细胞比例显著降低，而vCAF1细胞比例增加（图5b，c）。CAF亚群特征基因表达结果显示（图5d），RCT后CAF血管生成特征减少，炎症评分增加（图5e，f）。肿瘤特征分析显示，在RCT治疗期间，TNF和JAK/STAT通路表达上调，血管生成通路表达下调（图5g）。血管生成和免疫抑制均促进肿瘤生长，这些数据表明RCT可能减弱CAF肿瘤促进的功能。
图5：RCT减弱癌相关成纤维细胞促瘤特征
6. RCT过程中内皮细胞增强血管生成、缺氧和炎症基因表达
作者鉴定出五个内皮细胞亚群（ECs）（图6a）。GO结果显示，EC1富集于干扰素-γ通路和抗原处理与呈递，EC2富集于上皮细胞迁移，EC3富集于细胞基质粘附，EC4富集于DNA损伤检查，EC5富集于白细胞趋化（图6b）。RCT期间，EC2细胞比例显著降低，RCT后的EC2-4细胞比例占所有EC的一半以上（图6c，d）。基因的表达和GO相关的EC发展、血管重塑以及缺氧在RCT期间富集于EC中，尤其是EC2-4（图6e、f）。除了血管生成增强，参与上皮增殖的基因在内皮细胞中表达也显著上调（图6e，f）。此外，RCT后缺氧、血管生成以及炎症相关基因显著富集，包括TNF-κB和白细胞介素相关通路（图6g）。
图6：RCT增强内皮细胞血管生成、缺氧和炎性特征
7. 细胞亚群和细胞相互作用的临床意义
为了解这些细胞亚群的临床作用，作者使用CIBERSORTx来评估亚群细胞丰度。他们发现，vCAF2、Exhausted_CD8_T和EC2与宫颈癌患者预后不良显著相关，而GZMK_CD8_T与预后良好显著相关（图7a）。此外，作者还研究了RCT前后样品中上皮细胞、NK细胞、T细胞、M-MDSCs、巨噬细胞、DC和CAFs中细胞-细胞相互作用网络（图7b）。RCT后，M-MDSCs、NK细胞和CAFs具有更多的传入相互作用，而上皮细胞、T细胞和DC具有较少的传入相互作用（图7b）。对于传出相互作用，M-MDSCs、NK细胞和巨噬细胞在RCT后表现出较少的相互作用，而上皮细胞和CAFs表现出更多的相互作用。同时，作者观察了RCT前后细胞亚群之间趋化因子的配体-受体相互作用（图7c）。与RCT前相比，RCT后上皮细胞与M-MDSCs之间以及CAFs与M-MDSCs之间存在更多的相互作用。而NK细胞在RCT后与CCL5-CCR1具有更强的相互作用。
图7：细胞亚群临床作用和细胞互作
结论
作者展示了RCT诱导肿瘤生态系统重塑的综合转录景观。他们发现，RCT后留下了上调MHC II类基因表达的上皮细胞以及恶性上皮细胞。另外，RCT可引起抗肿瘤免疫反，包括募集表达细胞毒性基因的CD16+NK细胞和增加促炎特征的FCN1+M-MDSC细胞。
实验方法
scRNA-seq，免疫组化染色
参考文献
Liu C, Li X, Huang Q, Zhang M, Lei T, Wang F, Zou W, Huang R, Hu X, Wang C, Zhang X, Sun B, Xing L, Yue J, Yu J. Single-cell RNA-sequencing reveals radiochemotherapy-induced innate immune activation and MHC-II upregulation in cervical cancer. Signal Transduct Target Ther. 2023 Jan 30;8(1):44. doi: 10.1038/s41392-022-01264-9. PMID: 36710358; PMCID: PMC9884664.