可变剪接介导新circRNA生物发生揭示KRAS突变介导的胰腺癌淋巴转移

       在约90%的胰腺导管癌癌（PDAC）患者中鉴定出KRAS突变，并且KRASG12D是PDAC中最常见的等位基因。靶向KRAS^G12D突变的基因疗法在转移性PDAC中实现了70%的消退，表明靶向KRAS^G12D在转移性PDAC中的治疗潜力。本文找到了一个新的circRNA，其在KRAS^G12DPDAC中上调，并且与KRAS^G12D PDAC淋巴结（LN）转移正相关。在机制上，KRAS^G12D ‍PDAC中的circARFGEF生物发生被选择性剪接因子QKI-5显著激活，促进了circARFGEF生物发生。并探讨了circARFGEF海绵化miR-1205并促进JAK 2的活化，JAK2将STAT3磷酸化触发KRAS^G12D PDAC淋巴管生成和LN转移。本文于2023年6月，发表于《Cancer Research》上，IF=11.2。‍

1.circARFGEF在LN转移的KRAS^G12DPDAC中高表达

       为了研究circRNA是否参与KRAS^G12D驱动的LN转移，在3个配对的PDAC组织和9个正常的邻近组织（NAT）（GSE234760）中进行了二代测序，发现了circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC组织中最显著上调，与具有其他KRAS亚型的PDAC组织相比（KRAS^G12C、KRAS^G12V、KRAS^WT）（图1A和B）。此外，circARFGEF2 在LN阳性KRAS^G12D PDAC 患者或具有高度病理性肿瘤淋巴结转移（TNM）阶段的患者中过表达，并且与原发性肿瘤相比，转移性LN具有更高的circARFGEF2 表达（图1C和D）。原位杂交（ISH）和免疫荧光分析显示，circARFGEF2过表达伴随着KRAS^G12DPDAC组织中的微淋巴管密度（MLD）增加（图1 E和F）。此外，荧光原位杂交（FISH）揭示了在LN阳性KRAS^G12D PDAC组织中的circARFGEF2富集，与LN阴性相比（图1G和H），表明circARFGEF 2与KRAS^G12D PDAC的LN转移正相关。Kaplan-Meier存活分析表明，在患有KRAS^G12D PDAC的患者中，circARFGEF2过表达与总存活（OS）和无病存活（DFS）呈负相关（图1 I和J）。此外，在使用互补DNA（cDNA）而不是基因组DNA（gDNA）作为模板的PCR产物中检测到circARFGEF 2（图1 K）。与ARFGEF2 mRNA相比，circARFGEF2表现出对RNaseR的更强抗性，而Actinomycin D测定表明circARFGEF2具有比ARFGEF2 mRNA更长的半衰期（图1 M和N）。总之，这些发现证明circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC患者中高表达且具有高度稳定的结构。

图1：circARFGEF2在LN转移的KRAS^G12D PDAC患者

2.QKI-5与circARFGEF2结合加速在circARFGEF2在LN转移的KRAS^G12DPDAC中的生物合成
       用circRNA构建了6个双色荧光报告子给予IRES介导的GFP翻译，并将线性mRNA用mCherry标记以同时定量ARFGER2前体mRNA的线性和circRNA 剪接（图2A）。在PANC-1细胞中应用KRAS^G12D抑制剂MRTX1133或KRAS^G12D siRNA后，由HA-mCherry表达指示的线性ARFGEF2增加，并且由FLAG-GFP表达指示的circARFGEF2形成以及GFP-mCherry比率显著减少。而在Mia PaCa-2（KRAS^G12C）和BxPC-3（KRAS^WT）细胞中应用MRTX1133后未观察到明显变化（图2B-D）。已经证明了QKI在circRNA生物发生中的关键作用。因此，在3对KRAS^G12D PDAC组织和NAT中进行二代测序以评估QKI是否调节KRAS^{G 12D} PDAC中的circARFGEF2生物发生，并确定QKI在KRAS^G12D PDAC组织中上调（GSE 234927）（图2E）。双色荧光报告基因测定显示，下调QKI表达的显著降低了GFP-mCherry比率（图 2F和G），表明QKI是circARFGEF2生物发生所需的。双色荧光报告测定和蛋白质印迹测定，并揭示降低QKI-5表达显著降低FLAG-GFP表达，同时增加HA-mCherry表达（图2H）。前体mRNA选择性剪接通常由剪接体催化，剪接体的组装与相关的蛋白辅因子相伴逐步发生。免疫共沉淀（Co-IP）测定，随后质谱（MS）和蛋白质印迹鉴定出QKI-5与U2辅助因11（U2AF35）相互作用，直接触发剪接体组装以刺激剪接的U2AF亚基（图2 I和J）。此外，降低U2AF35表达显著阻碍QKI-5诱导的circARFGEF2生物发生（图2K和L）。上述结果表明QKI-5募集U2AF35来调节ARFGEF2前体mRNA剪接，并促进circARFGEF2生物合成。为了证实ARFGEF2前mRNA上的精确QKI-5结合位点，我们用内含子3和6的截短序列进行了下拉测定，其揭示了QKI-5特别富集内含子3^{1000-1200 nt}和内含子6^{7600-7800 nt}（图2 M和N）。内含子3^{1128-1180 nt}和内含子 6^{7672-7740 nt}的突变损害QKI-5和ARFGEF前mRNA结合，表明QKI-5 直接结合这两个ARFGEF2前mRNA区域（图2 O和P）。此外，我们评估了QKI-5和ARFGEF2前mRNA之间的相互作用是否影响PDAC中的circARFGE 2产生。CRISPR/Cas9介导的ARFGEF2前mRNA中内含子3^{1128-1180 nt}和内含子6^{7672-7740 nt}的敲除显著降低了QKI-5介导的circARFGEF2过表达（图2Q）。总之，我们的结果证明QKI-5募集U2AF35并结合内含子3^{1128-1180 nt}和6^{7672-7740 nt}的转录水平，以促进circARFGEF 2剪接（图2R）。

图2：QKI亚群结合至circARFGEF2剪接外显子的侧翼内含子，并加速KRAS^G12D PDAC中的circARFGEF2生物合成

3.增加circARFGEF2生物合成促进KRAS^G12D PDACLN转移
       circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC细胞中下调抑制HLEC管形成和迀移能力，而circARFGEF2过表达促进KRAS^G12D PDAC细胞诱导的HLEC管形成和迀移（图3A和B）。进一步评估QKI-5是否调节KRAS^G12D PDAC中的circARFGEF 2诱导的管形成和迀移，并且证明QKI-5过表达增强HLEC管形成和迀移能力，而下调circARFGEF2表达抑制QKI-5诱导的HLEC的淋巴管生成（图3C）。QKI-5过表达显著促进了KRAS^G12D PDAC细胞的LN转移，而下调circARFGEF2的明显逆转了这种作用（图3D）。原发性肿瘤的免疫组织化学（IHC）分析表明，降低circARFGEF2表达逆转了由QKI-5上调诱导的MLD的增加（图3E）。使用正电子发射断层扫描-计算机断层扫描18（PET-CT）扫描来评估裸鼠的原位致瘤性，发现QKI-5促进KRAS^G12D PDAC细胞的原位致瘤性，而当circARFGEF2下调时，这种作用受到阻碍（图3F）。IHC结果显示，QKI-5可显著促进癌细胞向胰周淋巴结转移，增加胰腺移植瘤模型中转移淋巴结的数量，同时降低circARFGEF 2的表达可以逆转这种效应（图3G）。综上所述，上述结果表明QKI-5介导的circARFGEF2促进体外KRAS^G12D PDAC淋巴管生成以及体内KRAS^G12D PDAC LN转移。

图3：QKI-5介导的circARFGEF2促进体外KRAS^G12D PDAC淋巴管生成以及体内KRAS^G12D PDAC LN转移

4.circARFGEF2海绵化KRAS^G12D PDAC中的miR-1205

       研究circARFGEF2诱导KRAS^G12D PDAC LN转移的机制。首先确定了circARFGEF2主要位于KRAS^G12D PDAC细胞的细胞质中（图4A和4 B）。
       通过数据库预测和验证发现这些miRNA中，miR-1205最特异地在KRAS^G12D PDAC细胞系中过表达，而不是具有其他KRAS亚型的PDAC细胞系中过表达。RNA下拉测定揭示，与Oligo探针相比，在KRAS^G12D PDAC细胞而不是KRAS^WT PDAC细胞中，miR-1205被circARFGEF 2探针显著富集（图4C）。circARFGEF 2和miR-1205 序列的分析揭示了反向互补序列的存在（图4D）。双荧光素酶报告基因测定揭示miR-1205显著降低circARFGEF2组的荧光素酶活性，而反向互补序列的突变削弱了这种作用（图4 E），表明circARFGEF 2通过特异性序列海绵化miR-1205。此外，FISH测定证明circARFGEF2和miR-1205共定位在KRAS^{G 12D} PDAC细胞的细胞质中（图4F），表明 circARFGEF2和miR-1205之间的相互作用。体外实验表明，过表达circARFGEF2的触发HLEC管形成和迀移，而过表达miR-1205的明显逆转了这种作用（图4G）。综上所述，结果表明circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC细胞中充当miR-1205海绵。
       KEGG通路分析揭示JAK-STAT途径是与circARFGEF2相关的最显著富集的通路（图4H）。JAK代表用于激活JAK-STAT途径的核心组分，并且由JAK 1、JAK 2、JAK 3和TYK 2组成。随后，检测了JAK亚型的表达谱，发现JAK 2与KRAS^G12D PDAC细胞中circARFGEF 2的表达正相关（图4I）。此外，miR-1205与KRAS^G12D PDAC细胞中的JAK2表达负相关（图4J和K）。双荧光素酶报告基因测定表明，miR-1205明显降低JAK2 3′UTR荧光素酶构建体中的荧光素酶活性，而不是miR-1205结合位点中的突变序列（图4L）。miR-1205过表达明显抑制circARFGEF2诱导的JAK2表达，这表明 circARFGEF2充当miR-1205海绵以增加JAK2表达（图4 M和N）。WB显示circARFGEF2过表达促进JAK2表达和STAT 3磷酸化（图4O），而circARFGEF2下调降低JAK2表达并抑制STAT 3磷酸化（图4P）。

图4：circARFGEF2海绵化KRAS^G12D PDAC中的miR-1205并激活KRAS^G12D PDAC中的JAK2-STAT3信号通路

5.JAK2-STAT3通路阻断抑制circARFGEF 2诱导的KPC小鼠LN转移

       circARFGEF2过表达显著促进HLEC管形成和迀移能力，而JAK2-STAT3通路抑制剂WP1066显著逆转该作用（图5A和B）。此外，体内实验证明，与对照裸小鼠相比，circARFGEF2过表达裸小鼠具有更大的膝弯淋巴结转移瘤，并且WP1066显著阻碍circARFGEF2诱导的LN转移（图5C和D）。IHC分析显示，circARFGEF2过表达促进膝弯LN的转移，增加足垫肿瘤中的MLD，而抑制JAK 2-STAT3通路逆转了这些作用（图5E和F）。这些结果表明，circARFGEF2 通过JAK2-STAT3通路促进KRAS^G12D PDAC中的淋巴管生成和LN转移。为了更好地理解circARFGEF2在体内KRAS^G12D PDAC LN转移中的作用，使用工程化的转基因Kras^G12D/+ Trp 53 ^{R172 H/+}Pdx-1-Cre（KPC）小鼠模型。结果表明circARFGEF2过表达显著增加了原发性PDAC肿瘤体积，并且抑制JAK2-STAT3信号通路则逆转了这种作用（图6A和B）。此外， circARFGEF2过表达显著增加了KPC小鼠中转移性腹部LN的数量和原发性PDAC肿瘤中的MLD，而阻断 JAK 2-STAT 3信号传导途径阻碍了这些作用（图6C和D）。这些结果表明，阻断JAK2-STAT3通路对CircARFGEF2诱导的KRAS^G12D PDAC的淋巴管生成和LN转移表现出抑制作用。

图5：JAK2-STAT3通路阻断抑制circARFGEF 2诱导的KPC小鼠LN转移

6.KRAS^G12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2轴的临床相关性

       评估 QKI-5介导的circARFGEF2-miR-1205-JAK2轴在患有KRAS^G12D PDAC的患者中的临床意义。结果表明，与NAT相比，miR-1205在KRAS^{G 12D} PDAC组织中下调，并且circARFGEF2、QKI-5、JAK2在KRAS^G12D PDAC组织中上调（图6 E和F）。此外，miR-1205与LN转移负相关，而circARFGEF 2、QKI-5和JAK2在LN转移性KRAS^G12D PDAC组织中显著上调（图6 G和H）。IHC分析显示，QKI-5和JAK2与KRAS^G12D PDAC组织中的circARFGEF2表达正相关（图6 I-K）。相关性分析揭示JAK2与miR-1205表达负相关，而与QKI-5表达正相关，并且在circARFGEF2和miR-1205表达之间观察到负相关（图6L和M）。总之，这些研究结果表明，来源于QKI-5依赖性剪接的circARFGEF2海绵化miR-1205并激活JAK2-STAT3信号传导通路以诱导KRAS^G12D PDAC LN转移。

图6：KRAS^G12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2轴的临床相关性

结论
       总之，本文提出了KRAS^G12D突变驱动的 circARFGEF2生物合成的新机制，其经由QKI-5依赖性剪接介导miR-1205-JAK2-STAT3轴以触发PDAC LN转移。抑制circARFGEF2表达或JAK2-STAT3通路显著阻碍了KPC模型中的肿瘤生长。这些发现使得能够对PDAC LN转移中的调节机制有新的理解，表明circARFGEF2是KRAS^G12D PDAC中的潜在治疗靶标。

实验方法
临床样本收集，RNA测序和数据分析，免疫组化，膝弯淋巴结转移模型，体外移植瘤模型， Kras^G12D/+Trp53^R172H/+Pdx-1-Cre (KPC)小鼠注射AVV载体，质粒和siRNA转染，CRISPR/Cas9介导的基因敲除，荧光原位杂交实验，琼脂糖凝胶电泳，RNase R消化和Actinomycin D处理实验，RNA下拉实验，Transwell，管形成实验，5-EDU实验，双荧光素酶实验，WB，RT-qPCR，亚细胞分离试验。
参考文献
Kong, Y., Luo, Y., Zheng, S., Yang, J., Zhang, D., Zhao, Y., Zheng, H., An, M., Lin, Y., Ai, L., Diao, X., Lin, Q., Chen, C., & Chen, R. (2023). Mutant KRAS mediates circARFGEF2 biogenesis to promote lymphatic metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer research, CAN-22-3997. Advance online publication. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-3997