靶向m7G-SLUG/SNAIL轴——在射频消融不足后阻断肝细胞癌转移

       射频热消融是治疗肝细胞癌（HCC）的理想根治方法。然而，不充分的射频消融（IRFA）可能会导致肝癌的高复发率。在哺乳动物和酵母中，tRNA上的N7 -甲基鸟苷（m7G）是一种进化上保守的修饰，可调节热应激反应和肿瘤进展，但它在IRFA后HCC复发中的功能仍不清楚。本研究中，作者发现METTL1 介导的 m7G tRNA修饰在体外和体内亚致死热应激下促进HCC转移。机制上，METTL1介导的m7G tRNA修饰以依赖于密码子频率的方式选择性调控上皮-间充质转化（EMT）过程中关键基因SLUG/SNAIL的翻译。该研究于2023年6月发表在《Molecular Therapy》，IF：12.4。
技术路线

主要研究结果
1. HCC中亚致死热应激促进METTL1表达和m7 G修饰
       建立IRFA或HCC患者异种移植（PDX）小鼠模型，以高精度模拟临床HCC 消融。使用红外成像仪监测肿瘤过渡区（TZ）在41℃-50℃范围内遭受亚致死性热应激时的温度（图1A）。结果发现，IRFA 显著上调了TZ中m7G tRNA 修饰水平以及METTL1和WDR4的表达（图1B-1D）。METTL1 和 WDR4 在非肿瘤组织中的水平较低，但在RFA治疗后复发的HCC组织中的水平显著升高（图1E和1F）。亚致死性热处理可显著上调HCC患者衍生的类器官组织中METTL1 和WDR4的表达（图1G和1H）。在亚致死热应激HCC细胞模型中验证亚致死热处理会增加HCC细胞中m7G tRNA的修饰及METTL1/WDR4 的水平（图1I和1J）。这些数据表明，IRFA诱导的m7G tRNA 修饰上调可能与HCC在RFA 期间的耐热性有关。

图1. 暴露于亚致死热应激下的HCC中m7G tRNA修饰和METTL1/WDR4水平升高

2. 敲降METTL1抑制亚致死热应激下HCC细胞的恶性行为
       鉴于亚致死热应激会增加m7G tRNA的修饰和METTL1/WDR4的表达，作者推测METTL1 可能在亚致死热应激下发挥重要的致癌功能。northwestern blot（图2A）证明METTL1 基因敲低降低tRNA的m7G修饰。亚致死热应激显著抑制HCC细胞的生长（图2B）、克隆形成能力（图2C、2D）和细胞周期进展（图2E），而 METTL1 的缺失进一步抑制亚致死热处理下HCC细胞的生长和克隆形成。另一方面，亚致死热应激会诱导HCC细胞凋亡，当 METTL1 被沉默时，这一趋势更加明显（图2F）。此外，亚致死热处理显著促进三种HCC细胞的迁移和侵袭能力，但METTL1沉默会显著削弱这一趋势（图2G-2J）。这些数据表明，METTL1 在亚致死热应激下对HCC的恶性特征起着重要作用。

图2. 敲低METTL1抑制亚致死热应激下HCC细胞的恶性行为

3. 过表达METTL1以m7G tRNA 修饰依赖的方式促进HCC细胞在亚致死热应激后的恶性能力
       在HCC细胞中过表达野生型（oeWT）及其无催化活性突变体（oeMUT）METTL1。与oeNC 相比，在含有oeWT METTL1 而非oeMUT METTL1的HCC 细胞中观察到tRNA 中m7G修饰水平增加（图3A）。在正常培养条件下，oeWT METTL1 显著促进HCC细胞生长（图3B）、克隆形成（图3C、3D）、迁移（图3E、3F）和侵袭（图3G、3H）。然而，过表达无催化活性突变体METTL1 对HCC的进展影响甚微（图3B-3H）。同样，在亚致死热处理条件下，过表达 WT METTL1 而非突变体METTL1显著促进HCC细胞的恶性发展（图3B-3H）。这些数据表明，在亚致死性热应激下，METTL1以m7G tRNA甲基转移酶活性依赖的方式对HCC细胞恶性化至关重要。

图3. 过表达METTL1以m7G tRNA 修饰依赖的方式促进HCC细胞在亚致死热应激后的恶性能力

4. 亚致死热应激通过METTL1-m7G 介导的翻译控制机制提高HCC细胞的恶性潜能
       TRAC-seq结果显示，亚致死热处理后，HCC细胞中的tRNA m7G修饰显著上调（图4A、4B）。此外，大多数经m7G修饰的tRNA的表达水平在亚致死热处理后也有所提高，尤其是ThrTGT和LysCTT tRNA（图4C）。翻译预测进一步发现，亚致死热应激后，关键EMT 基因SLUG和SNAIL的翻译效率显著增加，而敲除METTL1会减少热处理HCC细胞中这两个基因的mRNA翻译（图4D 和4E）。消耗METTL1会显著降低SLUG 和SNAIL 的蛋白水平和mRNA 翻译效率，这表明METTL1 促进热处理HCC细胞中SLUG和SNAIL mRNA的翻译（图4F、4G）。此外，tRNA LysCTT在热处理后显著增加（图4C）。这些数据表明，m7G tRNA，特别是tRNA LysCTT，以依赖于密码子频率的方式调节SLUG 和SNAIL的翻译。因此，作者进行LysCTT挽救实验，发现在缺失METTL1 的细胞中过表达LysCTT可在热致死性应激后挽救SLUG 和SNAIL 的蛋白水平（图4H），从而加强METTL1介导的tRNA m7G修饰与SLUG和SNAIL mRNA 翻译之间的功能联系。

图4. 亚致死热应激以m7G tRNA密码子频率依赖的方式提高SLUG/SNAIL的翻译效率

5. SLUG/SNAIL异位表达挽救亚致死性热应激下METTL1 敲低的 HCC 细胞的恶性能力
       在METTL1稳定敲除的HCC细胞中过表达SLUG/SNAIL进行挽救试验（图5A）。数据显示，在亚致死性热应激下，过表达SLUG或SNAIL能显著促进METTL1敲除HCC细胞的生长和菌落形成（图5B-5D）。此外，在过表达SLUG/SNAIL后，METTL1敲除的HCC细胞的迁移和侵袭能力得到恢复（图5E-5H）。因此，SLUG/SNAIL是METTL1的重要下游靶标，在亚致死性热应激下提高HCC细胞的恶性潜能。

图5. SLUG/SNAIL异位表达挽救亚致死性热应激下METTL1敲低的HCC细胞的恶性能力

6. METTL1 加速体内热处理后HCC的转移
       利用体内HCC转移模型进一步研究METTL1在IRFA后HCC复发中的致癌功能。在脾内注射模型中，将经过热处理的METTL1敲除的MHCC97H细胞和对照细胞注入NCG小鼠脾脏，以评估肝转移情况（图6A）。数据显示，经热处理的对照组细胞形成了更多的肝转移瘤（7/7），而 METTL1 敲除组则显著减少HCC肿瘤（分别为3/7和2/7）（图 6B-6F）。此外，肿瘤组织中METTL1、WDR4、Ki-67、SLUG和SNAIL 的表达水平以及m7G tRNA的修饰水平在热处理对照组中均有所上升，而在METTL1敲除组中则有所下降（图6G-6M）。进一步用敲除METTL1的MHCC97H细胞建立尾静脉注射模型（图7A），以评估 METTL1在热处理后调控肺转移的功能。结果发现，正如预期的那样，热处理后对照细胞组出现更多的肺转移（图7B、7D和7E）。肺重量与体重的比值也显示亚致死性热应激诱导的肺转移负担更高（图7C）。重要的是，消耗METTL1显著抑制HCC 细胞的肺转移和增殖活性，这一点从尾静脉注射模型中肿瘤负荷的减少和Ki-67水平的降低可以看出（图7F-7I）。因此，这些数据揭示METTL1 在热处理后对体内转移的促进具有重要作用。

图6. METTL1缺失在体内显著抑制亚致死性热应激下HCC细胞的肝内转移

图7. METTL1缺失在体内显著抑制亚致死性热应激下HCC细胞的肺转移

7. METTL1在体内促进IRFA后的HCC转移
       在原位异种移植HCC模型中进行IRFA。8周后对小鼠进行解剖以评估不同器官（包括肝脏和肺脏）的转移情况（图8A）。对所有组织进行HE染色定量后，发现shNC + IRFA 组（7/7）肝内转移较多（图8B、8C、8E 和8F）。值得注意的是，在shNC + IRFA 组发现了肝外转移，包括肺、腹壁、脾、肾、膈、肠和肠系膜（图8D、8G、8H）。正如预期的那样，METTL1基因敲除显著抑制IRFA 诱导的肝转移和其他器官转移，尤其是肺转移的趋势。这些数据证明METTL1在IRFA后促进HCC转移的关键生理功能。

图8. METTL1在体内促进IRFA后的HCC转移

结论
       综上所述，本研究提供了证据，证明在亚致死热应激下，METTL1通过促进SLUG/SNAIL mRNA翻译，以m7G tRNA修饰依赖的方式促进HCC转移，为防止射频热消融治疗后HCC转移提供了分子基础。

实验方法
细胞培养，动物实验，细胞活力和克隆形成检测，细胞周期和细胞凋亡检测，迁移和侵袭实验，RNA提取和RT-qPCR，northern blot，northwestern blot，western blot，HE染色，免疫组化分析，多聚核糖体结合mRNA测序， m7G tRNA还原和断裂测序（TRAC-seq），质粒构建和慢病毒转导，体外亚致死热处理模型构建，体内射频消融不充分（IRFA）实验，IRFA动物模型构建，转移动物模型构建
参考文献
Zhu S, Wu Y, Zhang X, Peng S, Xiao H, Chen S, Xu L, Su T, Kuang M. Targeting N7-methylguanosine tRNA modification blocks hepatocellular carcinoma metastasis after insufficient radiofrequency ablation. Mol Ther. 2023 Jun 7;31(6):1596-1614. doi: 10.1016/j.ymthe.2022.08.004. Epub 2022 Aug 13. PMID: 35965412; PMCID: PMC10278047.