已确认：索拉菲尼诱导胃癌细胞铁死亡

       索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，在包括胃癌（GC）在内的多种癌症中作为铁死亡诱导剂具有重要的抗肿瘤作用。然而，最近索拉非尼作为铁死亡诱导剂的状态受到质疑。关于铁死亡和ATF2之间关系的信息非常有限，且ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的作用尚未被研究。在本文中，作者探讨了GC中ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的作用及其相关分子机制。本文于2023年1月发表在《Redox Biology》IF:11.4期刊上。

技术路线

主要实验结果
1、ATF2在胃癌中表达上调并预示不良预后
       TCGA数据库显示与正常组比较，ATF2 mRNA表达在肿瘤中显著上调（图1A）。此外，与正常细胞系GES-1比较，GC细胞系中ATF2的蛋白表达显著上调（图1B），该结果被临床12对癌与癌旁的检测结果所验证（图1C）。使用IHC检测了107例GC组和22例正常组织中ATF2的表达，代表性图像见图1D，结果发现GC组织中61.7%的样本ATF2高表达，而癌旁中63.6%的样本ATF2低表达（图1E）。结合患者预后的生存分析显示ATF2高表达组的总体生存期显著下降（图1F）。KM数据库得出了类似的结论（图1G）。总之，ATF2在GC中表达上调并预示不良预后。

图1 ATF2在GO中上调且预测不良预后

2、ATF2促进GC细胞恶性表型
       如图2所示，在GC细胞中敲低ATF2后显著抑制细胞的增殖迁移和侵袭，过表达ATF2则相反，表明ATF2促进GC细胞恶性表型。

图2 ATF2敲低抑制GC细胞恶性表型

3、索拉非尼诱导GC细胞铁死亡
       由于先前的研究表明索拉非尼诱导铁死亡的不确定性，作者首先探究了索拉菲尼是否诱导GC细胞铁死亡。如图3A所示，索拉菲尼处理细胞24h后，AGS和MGC-803细胞形态呈现出收缩，变圆，排列松散，而同时使用铁死亡抑制剂Fer-1处理则可反转这种效果。与对照组相比，索拉非尼处理导致总细胞ROS和脂质ROS均显著增加（图3B-C），并且导致MDA水平增加（图3D），GSH水平下降（图3E），然而Fer-1处理抑制上述效果。

图3 索拉非尼诱导AGS和MGC-803细胞铁死亡

       鉴于铁死亡与线粒体功能息息相关，因此，作者进一步检测了索拉菲尼对MMP和线粒体形态的影响。JC-1染色结果显示，与对照组比较，索拉菲尼显著减低AGS和MGC-803细胞MMP（图4A）。此外，TEM显示索拉菲尼处理的MGC803细胞线粒体嵴明显减少或缺失，线粒体膜密度增加（图4B）。这些结果表明索拉非尼可以诱导GC细胞的铁死亡。
       作为一种关键的应激反应转录因子，ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的表达变化尚不清楚。如图4C所示，索拉非尼处理增加ATF2的表达，尤其是磷酸化形式。免疫荧光显示，索拉非尼刺激后ATF2在细胞核中的表达更高（图4D）。因此，索拉非尼诱导的铁死亡可能会促进ATF2的核转位并增强ATF2在GC细胞中的转录活性。

图4 索拉非尼处理增加GC细胞中ATF2的表达并促进其核易位

4、ATF2敲低抑制索拉菲尼诱导的GC细胞铁死亡
       如图5A所示，敲低ATF2导致GC细胞的IC50下降，过表达则相反。此外，索拉菲尼和ATF2敲低均显著增加细胞内总ROS和脂质ROS含量，而两者同时进行则进一步促进其增加，但是，索拉菲尼处理同时过表达ATF2则显著回落ROS的水平（图5B-C）。类似的，过表达ATF2可显著逆转因索拉菲尼处理引起的MDA增加（图5D）和GSH下降（图5E），以及线粒体形态改变（图5F）。这些发现表明ATF2过表达抑制索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡。

图5 ATF2敲低抑制索拉菲尼诱导的GC细胞铁死亡

5、ATF2在GC细胞中激活HSPH1的转录
       为进一步阐明ATF2的潜在机制，进行RNA-seq和ChIP-seq分析，以鉴定ATF2的全基因组DNA结合位点和潜在转录靶点。如图6A所示，RNA-seq分析显示，与对照组相比，MGC803细胞中ATF2敲除后，1059个基因上调，370个基因下调。重要的是，RNA-seq数据的通路富集分析表明，ATF2敲除明显影响铁死亡通路（图6B）。ChIP-seq共鉴定出24119个峰，对应3641个RefSeq基因，其中2.88%位于启动子-转录起始位点（图6C）。在染色体上观察到了不同的峰值，并扫描了峰值之间共享的motifs（图6D和E）。

图6 RNA-seq和ChIP-seq鉴定ATF2的全基因组DNA结合位点和转录靶点

       然后对RNA-seq和ChIP-seq数据进行交叉分析，筛选出222个受ATF2直接调控的候选转录靶标（图7A）。其中，HSPH1在ATF2敲除后显著下调（图7B）。此外，在TCGA数据集中，HSPH1在GC中的表达与ATF2呈显著正相关（图7C）。如图7D所示，ChIP-seq数据显示在HSPH1的启动子区域有明显的ATF2结合峰。因此，推测HSPH1可能是ATF2的潜在靶基因。WB分析结果显示，HSPH1在ATF2过表达后增加，而在ATF2敲除后减少（图7E）。此外，ChIP-qPCR进一步证实ATF2可以结合到HSPH1的启动子区域（图7F）。这些数据表明ATF2可以通过与HSPH1启动子结合来激活HSPH1的表达。

图7 ATF2与HSPH1启动子结合激活其转录

6、HSPH1与SLC7A11结合并增加其稳定性
       鉴于一些研究报道了HSP蛋白在铁死亡中的突出作用，作者试图确定HSPH1是否可能影响SLC7A11在GC中的表达。首先查询了GeneMANIA数据库，其预测并显示了HSPH1和SLC7A11之间潜在的相互作用（图8A）。为验证这一预测，进行co-IP实验，确定HSPH1与SLC7A11存在物理相互作用（图8B）。接下来，采用siRNA敲除HSPH1的表达（图8C），并将HSPH1 siRNA转染到ATF2稳定过表达的AGS细胞中。观察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11的蛋白表达水平，但没有降低mRNA水平（图8D）。因此，进行了CHX试验，以确定在HSPH1敲除或未敲除的情况下SLC7A11蛋白的半衰期。WB分析表明，与对照组相比，抑制HSPH1加速了AGS细胞中SLC7A11蛋白的降解（图8E）。这些结果表明，HSPH1可以与SLC7A11相互作用，并至少部分地通过增加SLC7A11蛋白的稳定性来增加其表达。
       敲除HSPH1可以部分消除ATF2过表达对细胞ROS和脂质ROS的影响（图8F和G）。同样，与HSPH1 siRNA共转染可显著逆转ATF2过表达对铁死亡细胞MDA和GSH水平的影响（图8H和I）。这些结果为ATF2通过HSPH1调控索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡提供了证据。

图8 HSPH1与SLC7A11结合并增加其稳定性

7、ATF2敲低增加小鼠GC肿瘤对索拉菲尼的敏感性
       最后，为评估ATF2单独敲除和与索拉非尼联合敲除对体内GC的影响，建立了裸鼠异种移植模型（图9A）。与对照组相比，稳定敲除ATF2细胞形成的肿瘤体积更小，重量更轻，表明ATF2敲除可以有效抑制体内肿瘤的生长（图9B）。此外，索拉非尼治疗后，皮下肿瘤的体积和重量均显著进一步下降（图9C和D）。表明ATF2敲除联合索拉非尼治疗对肿瘤生长的抑制作用最强。为更好地观察潜在的铁死亡，皮下肿瘤切片被4-HNE染色，4-HNE是一种敏感的脂质过氧化标记物。IHC染色显示sh-ATF2+索拉非尼组4-HNE表达最高（图9E）。因此，ATF2敲除可增强索拉非尼对体内GC的抗肿瘤作用。

图9 ATF2敲低增加小鼠GC肿瘤对索拉菲尼的敏感性

       总之，作者发现索拉非尼激活ATF2的表达，并进一步促进HSPH1的表达，减少SLC7A11蛋白的降解，从而导致了对脂质过氧化的保护（图10）。因此，以ATF2/HSPH1轴为靶点增强索拉非尼诱导的铁变态反应是一种有吸引力的GC治疗策略。

图10 图像摘要

实验方法
临床收集福尔马林固定石蜡包埋的GC样本，细胞培养，WB，qRT‒PCR，免疫组织化学染色，细胞增殖曲线，半数抑制浓度（IC50）实验，Transwell迁移和侵袭实验，Calcein-AM/PI染色，细胞内ROS和脂质过氧化检测，MDA和GSH检测，线粒体膜电位（MMP）检测，透射电镜实验（TEM），RNA测序，染色质免疫共沉淀（ChIP）测序，ChIP-qPCR，co-IP，蛋白质稳定性实验，小鼠肿瘤模型
参考文献
Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2023 Feb;59: 102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564. 

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