心肌梗死后，乳酸诱导Snail1乳酸化促进内皮-间充质转化
高乳酸水平与心脏病患者的预后和死亡率呈正相关。内皮-间质转化（EndoMT）在心脏纤维化中起着重要作用。本研究中，作者报告了乳酸的新功能，即在心肌梗死（MI）后，通过促进EndoMT增加心脏纤维化并加剧心功能不全。机制上，乳酸能上调缺氧/ MI后Snail1的核转位和乳酸化。抑制Snail1可改善MI后乳酸诱导的心脏功能障碍，抑制乳酸刺激的EndoMT、Snail1的乳酸化和TGF-β/Smad2信号的激活。该研究于2023年2月发表在《Science Advances》，IF：13.6。
技术路线
主要研究结果
1. 减少乳酸改善MI后的心功能和心脏纤维化
腹腔注射糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）降低乳酸水平。2-DG 抑制MI引起的血清和心脏乳酸水平（图1A、B）。值得注意的是，2-DG MI 小鼠的射血分数（EF%）和缩短分数（FS%）水平高于对照组MI小鼠（图1C、D）。2-DG MI小鼠的左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）值低于对照MI小鼠（图E、F）这表明抑制乳酸生成改善MI后的心脏功能。此外，Masson三色染色显示给予2-DG减少MI后的心脏纤维化（图 1G）。这些数据表明乳酸的产生促进MI诱发的纤维化和心功能不全。
2. 增加乳酸生成加剧MI后的心功能不全和心脏纤维化
在诱导MI3小时后给小鼠补充乳酸，在MI1周和4周后用超声心动图评估心脏功能。图1H显示，腹腔注射乳酸（0.5 g/kg体重7天后，血清乳酸浓度恢复到正常水平。与假手术组相比，MI 显著降EF% 和FS% 的值（图1I 、J）与 MI 组相比，注射乳酸进一步降低EF%（7 天时降低14.0%，28 天时降低19.5%）和FS%（7 天时降低15.8%，28 天时降低21.6%）的值（图1I、J）。同样，乳酸处理也增加MI后LVEDV和LVESV的水平（图1K、L）这些数据共同表明，乳酸水平升高加重MI后的心脏功能障碍。Masson三色染色表明乳酸给药显著诱导MI小鼠的心脏纤维化（图1M）。
图1. 乳酸水平升高导致MI后心脏功能障碍恶化和心脏纤维化增加
3. 抑制乳酸生成减轻MI后的心脏EndoMT
与假手术组相比，MI诱导内皮标志物CD31和VE-cadherin（VE-钙粘蛋白）表达（图 2A）以及间充质标志物成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Collagen1a1 表达（图 2A）明显增加。施用2-DG抑制乳酸产生提高 CD31和VE-cadherin的表达，同时消除MI诱导的 Collagen1a1、α-SMA和FSP1 的减少（图2A）。同样，用2-DG 处理上调内皮标志物Cdh5和Kdr的mRNA水平（图2B）。相反，2-DG下调间质标志物Atca2、Col1a1、Fn1和S100a4的mRNA 表达（图2B）。总之，这些数据表明抑制乳酸减弱MI后的EndoMT进程。在添加或不添加2-DG的内皮细胞特异性绿色荧光蛋白（GFP）标记小鼠（TIE2GFP）中诱导MI，并用抗GF（绿色）和抗FSP1（红色）抗体对心脏组织进行免疫荧光染色。如图2C所示，与假手术组相比，MI 诱导GFP与FSP1的共定位。与此相反，2-DG抑制乳酸产生减轻MI诱导的GFP与FSP1的共定位，表明2-DG减少MI刺激的心肌EndoMT。此外，在MI或假手术后7天，从获得的心脏中分离出内皮细胞，流式细胞术检测分化成肌成纤维细胞的内皮细胞百分比。如图2D所示，从假手术组小鼠体内分离的内皮细胞显示，抗 CD31 和抗 CD114（内皮细胞标记物）抗体染色的GFP细胞最多，几乎检测不到Gp38（心脏成纤维细胞标记物）染色（图2E）。然而，MI明显增加GFP标记的内皮细胞中Gp38阳性染色细胞的数量和百分比。相反，用2-DG处理可抑制MI 诱导的Gp38阳性内皮细胞。
图2. 2-DG减弱MI诱导的EndoMT
4. 高水平乳酸促进MI后心肌中的EndoMT
WB显示，对MI小鼠补充乳酸降低内皮细胞标记物（CD31和VE-cadherin）的水平，促进间充质标记物（FSP1、α-SMA和Collagen1a1）的表达（图3A）qRT-PCR显示，乳酸水平升高导致MI后Cdh5和Kdr mRNA水平降低（图3B、C），并诱导Col1a1、Fn1和S100a4 mRNA水平升高（图3D- F），表明乳酸诱导MI 后的EndoMT。用抗 GFP（绿色）和抗 FSP1（红色）抗体进行免疫荧光染色显示，与假手术组小鼠相比，MI 诱导GFP和FSP1的共定位（图3G），这表明乳酸盐处理后有更多的内皮细胞分化成成纤维细胞。同样，流式细胞术显示，MI 后乳酸盐处理进一步上调GFP+gp38+ 细胞的数量（图3H），表明乳酸盐促进MI后的EndoMT。
图3. 补充乳酸盐促进MI后的EndoMT
5. 缺氧后，乳酸盐刺激内皮细胞迁移、降低VE-cadherin的表达，并促EndoMT
进行伤口愈合试验和EdU掺入试验，图4A显示，与常氧对照组相比，缺氧加速内皮细胞的迁移。此外，10 mM（而非5 mM）的乳酸显著促进缺氧诱导的伤口愈合（图4A），表明乳酸盐能诱导缺氧挑战下的内皮细胞迁移。同样，EdU掺入试验再次证明乳酸盐能促进缺氧刺激的内皮细胞增殖（图4B）。VE-cadherin的免疫荧光染色显示，缺氧72小时后，VE-cadherin的完整性受到破坏（图4D）。缺氧后，用10 mM乳酸盐处理进一步破坏内皮细胞表面的VE-cadherin完整性（图4D）。此外，WB和 qRT-PCR 分析显示，与缺氧组相比，乳酸处理显著降低VE-cadherin的水平（图4C、5C），表明乳酸改变缺氧挑战下内皮细胞的表型。用乳酸处理内皮细胞，检测缺氧后EndoMT的标记物。如图5A所示，缺氧72小时后，内皮细胞的形态从典型形状变为拉长的纺锤形外观。与缺氧对照组相比，乳酸处理导致细胞形态发生更大变化。此外，拉长细胞的FSP1染色呈阳性，CD31 染色呈阴性（图5B）。图5C显示，缺氧挑战后，乳酸减少VE-cadherin的表达并诱导α-SMA的释放。进行基于Matrigel的内皮细胞血管生成试验，发现乳酸的施用抑制缺氧诱导的血管生成（图5D）。此外，利用胶原凝胶收缩试验，证实乳酸处理的内皮细胞在缺氧刺激后表现出类似间充质的功能，这表现在胶原凝胶体积减小和收缩力增强（图5E）。总之，这些数据表明缺氧后乳酸诱导EndoMT。
图4. 缺氧后，乳酸诱导内皮细胞迁移并减少VE-cadherin的表达
图5. 缺氧后，乳酸促进内皮细胞中EndoMT
6. 缺氧后乳酸激活TGF-β/Smad2信号传导
qRT-PCR显示，在体内乳酸显著加速MI后心肌中Tgfb1和Smad2 mRNA的表达（图6A、B）。然而，乳酸盐并没有改变Smad3的mRNA水平（图6C）。此外，2-DG抑制乳酸的产生降低MI诱导的Tgfb1和Smad2 mRNA表达（图6D、E）。体外研究也表明，乳酸促进缺氧挑战下的人脐带内皮细胞（HUVECs）和HCMECs中TGFB1和SMAD2 mRNA 的表达（图6F、G）。与基因表达水平一致，乳酸处理上调缺氧挑战后Smad2的磷酸化和TGF-β的表达，但不影响 Smad3的磷酸化（图6H）。这些数据综合表明，乳酸诱导的TGF-β/Smad2激活有助于缺氧后的EndoMT。
图6. MI/缺氧后，乳酸刺激TGF-β/Smad2信号传导
7. 抑制细胞内乳酸减轻缺氧诱导的EndoMT
CHC[单羧酸盐转运体（MCT）抑制剂α-氰基-4-羟基肉桂酸盐]降低乳酸处理诱导的细胞内乳酸水平（图7A），表明细胞外乳酸是通过MCT 转运到内皮细胞的。此外，服用CHC改善缺氧后乳酸促进的内皮细胞迁移（图7B）。免疫荧光染色显示，CHC阻乳酸处理导致的VE-cadherin表达减少（图7C），而血管形成试验表明，CHC促进缺氧后的血管生成（图7D）。此外，CHC还缓解乳酸诱导的内皮标志物PECAM1、CDH5和KDR mRNA水平的降低（图7E-G）以及间充质标志物ACTA2、FN1和COL1A1 mRNA水平的升高（图7H-J）。用CHC处理抑制乳酸诱导的TGFB1和SMAD2 mRNA的表达（图7K、L）。
图7. 抑制细胞内乳酸减弱缺氧诱导的EndoMT
8. 缺氧后乳酸促进Snail1的核转位
如图8A所示，单独缺氧不会改变Snail1的胞浆表达。然而，与常氧状态相比，缺氧后Snail1的核表达明显加快。乳酸处理进一步上调Snail1的核转位。免疫荧光染色显示，缺氧后Snail1核表达的阳性率更高，而乳酸进一步诱导Snail1核表达（图8B），表明Snail1的核转位在乳酸促进的EndoMT中发挥重要作用。用抗Snail1抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，图8C显示，在缺氧挑战的细胞中，Snail1与TGFB1 基因一起被大量招募。然而在乳酸处理的缺氧挑战细胞中，TGFB1基因和Snail1蛋白之间的相互作用明显大于缺氧细胞（图8C）。这些数据表明，乳酸促进Snail1蛋白和TGFB1基因的相互作用，从而有助于TGF-β/Smad2介导的EndoMT。
9. 缺氧后乳酸诱导Snail1乳酸化
使用抗Snail1抗体进行免疫沉淀，然后使用抗泛乙酰赖氨酸（Kac）或抗泛乳酸赖氨酸（Kla）抗体进行免疫印迹，结果显示缺氧诱导Snail1的乙酰化和乳酸化。给予乳酸进一步上调Snail1的乙酰化和乳酸化（图8D）。Snail1和CBP/p300之间存在相互作用，缺氧后乳酸处理促进它们之间的相互作用（图8D）。然而，给予CHC抑制细胞内乳酸可减轻乳酸促进的Snail1和CBP/p300之间的相互作用，以及Snail1的乙酰化和乳酸化（图8E）。反过来，与缺氧组相比，乳酸处理也显著增加抗CBP抗体、抗p300抗体、抗pan-Kla抗体和抗pan-Kac抗体免疫沉淀中Snail1的表达（图8F）。相比之下，给予CHC可减少Snail1与CBP/p300 之间的相互作用以及Snail1的乳酸化和乙酰化（图8F）。
图8. 缺氧后，乳酸促进Snail1的核转位和乳酸化
10. 沉默Snail1减弱缺氧后的EndoMT和TGF-β/Smad2激活
通过转染特异性siRNA沉默Snail1逆转缺氧后乳酸诱导的CD31和VE-cadherin下调（图9A）。相反，抑制Snail1阻止乳酸促进的间充质标志物α-SMA 和FSP1的表达（图9A）、SMAD2磷酸化和TGF-β激活（图9H）。qRT-PCR观察到在乳酸处理下，敲除Snail1提高PECAM1、KDR和CDH5的mRNA水平（图9B-D），降低ACTA2、COL1A1和S100A4的mRNA水平（图9E-G）。此外，沉默Snail1降低乳酸诱导的SMAD2和TGFB1 mRNA水平（图9I、J）。
图9. 沉默Snail1减轻缺氧后的EndoMT和TGF-β/Smad2的激活
11. 沉默Snail1改善MI后的心脏功能并减弱EndoMT
如图10（A和B）所示，与假手术组相比，MI显著促进Snail1的乳酸化和乙酰化，以及Snail1与CBP/p300之间的相互作用。乳酸给药进一步诱导它们之间的相互作用（图10A）。用2-DG处理减轻MI诱导的Snail1与CBP或p300之间的相互作用，并减少Snail1乙酰化和乳酸化（图10B）。转染特异性Snail1 siRNA，WB和免疫荧光染色证实，施用siSnai1显著降低Snail1在心脏中的表达（图10C、D）。然而，沉默Snail1逆转乳酸降低的EF%和FS%水平（图10E、F），并防止MI后乳酸诱导的LVEDV和LVESV水平升高（图10G、H），表明Snail1的缺失改善乳酸诱导的心脏功能障碍。此外，与MI后乳酸处理相比，沉默Snail1提高Cdh5和Kdr mRNA的表达（图10I、J），降低Acta2、Fn1和S100a4 mRNA的表达（图10K-M），表明Snail1有助于MI后乳酸诱导的EndoMT。这些数据表明，Snail1通过激活TGF-β/Smad2信号在乳酸促进的EndoMT中发挥重要作用（图10N）。
图10. 沉默Snail1减轻MI后Snail1的乳酸化和EndoMT
结论
综上所述，本研究发现乳酸发挥一种以前未知的功能，即在MI及缺氧后，乳酸通过激活TGF-β/ Smad2通路诱导EndoMT增加心脏纤维化并加剧心功能不全。这些发现加深了我们对乳酸在MI后EndoMT中作用的理解，并将成为开发创新疗法以改善MI后心脏重塑和功能的基础。
实验方法
siRNA体内转染，Masson三色染色，2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色，2,3,5-三苯基氯细胞凋亡检测，乳酸测定，流式细胞术，小鼠心脏内皮细胞的分离，细胞培养，增殖测定，血管生成试验，胶原凝胶收缩实验，免疫荧光，WB，qRT-PCR，免疫沉淀，ChIP-qPCR
参考文献
Fan M, Yang K, Wang X, Chen L, Gill PS, Ha T, Liu L, Lewis NH, Williams DL, Li C. Lactate promotes endothelial-to-mesenchymal transition via Snail1 lactylation after myocardial infarction. Sci Adv. 2023 Feb 3; 9 (5): eadc9465. doi: 10.1126/ sciadv. adc9465. Epub 2023 Feb 3. PMID: 36735787; PMCID: PMC9897666.