单细胞测序揭示特应性皮炎中的多细胞形态和互作
栏目：最新研究动态
发布时间：2023-12-13
本研究发现IL19+IGFL1+KCs可能参与了皮肤屏障的破坏、Th2和Th17炎症反应的连接和放大以及皮肤瘙痒的介导......
特应性皮炎（AD）是一种慢性、复发性炎症性皮肤病，以剧烈瘙痒和湿疹为特征。据报道，不同种族群体的特应性皮炎在临床、分子和遗传方面存在差异。本研究旨在对中国人群中的AD进行深入的转录组分析。ScRNA-seq共分析了 87,853个细胞，其中AD 中的角质细胞（KCs）表现出高表达的角质细胞活化和促炎症基因。KCs表现出一种新的IL19 + IGFL1 +亚群，在AD病变中有所增加。炎性细胞因子IFNG、IL13、IL26和IL22在AD病变中高表达。在体外，IL19直接下调HaCaT细胞中的KRT10和LOR，并激活HaCaT细胞产生TSLP。因此，IL19+IGFL1+KCs可能参与了皮肤屏障的破坏、Th2和Th17炎症反应的连接和放大以及皮肤瘙痒的介导。此外，在AD慢性病灶中会出现以2型炎症反应为主的多种免疫轴的进行性激活。本文于2023年6月发表在《Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology》IF：9.2期刊上。
技术路线
主要实验结果
1、AD和健康（HC）皮肤活检样本的scRNA-seq检测皮肤细胞类型
本文scRNA-seq的程序流程如图1a所示。使用降维分析展示了scRNA-seq检测到的9种细胞cluster和10种细胞类型（图1b）。顶端上调基因（根据平均log2(FC)和FDR）证实了细胞类型对特定簇的分配（图1c）。经典marker基因也证实了细胞类型的注释（图1d）。比较了AD组和HC组的细胞组成，发现在AD慢性病变中，基础KC的比例显著降低，而增殖KC的比例显著升高，符合AD的表皮过度增生和异常分化的本质，与此同时，AD慢性病变中黑素细胞的比例大幅下降（图1e,f）。
图1在AD和健康对照皮肤活检中的细胞类型
2、AD和HC中的角质细胞的分化
在两组中，所有四种KC簇都存在（图2a），并表现出相似的结构和增殖标记的表达。比较scRNA-seq数据中AD和HC组的差异表达基因（DEGs），发现低表达干细胞和基础角质形成细胞基因（KRT15, COL17A1），但高表达干扰素响应基因（IFI27, IFITM1）和基因SERPINB13，这些基因参与AD基础KC的角质形成细胞增殖和分化（图2b）。AD 基底上层KC的炎症转录本进一步明显上调，包括alarmins（S100A7、S100A8 和 S100A9）和Th 诱导基因SERPINB4；调节有丝分裂后细胞向分化的TXNIP6AD病变中的表达下降（图2c）。在增殖的 KC 中，AD患者的角朊细胞活化标志物KRT6A、KRT6B、KRT6C和KRT16以及趋化因子CCL2均显著上调（图2d）。在AD的晚期分化KC中，大量下调的基因包括编码屏障分子（FLG、LOR）和紧密连接复合体（CLDN1、OCLN）的基因。另一方面，参与局部炎症反应的IL36信号系统基因IL36RN、IL36G在AD晚分化KC中上调（图2e）。KCs DEGs的GO富集分析表明，主要的生物学过程包括先天免疫反应、激活信号转导、髓细胞分化、上皮细胞增殖、抗原加工和递呈、淋巴细胞分化（图2f）。
图2 AD与健康对照的角质细胞分化
所有单细胞的基因表达谱数据使作者得以解构KCs的时空分布。在HC中，作者发现了从干细胞基因（KRT15、COL17A1）富集的基底型KC到表达CDSN、FLG和LOR的晚分化型KC的双重推断分化轨迹（图3a,b），这与之前的报道一致。为了深入了解基因表达沿轨迹的动态变化，分析了基因的表达变化，观察到六大类转录基因簇的特征模式。Cluster 2的基因（如连接蛋白基因LAD1、皮肤屏障功能基因TMEM79和缝隙连接基因GJA1）表达上调并维持在高表达水平直至最后阶段，主要参与调控 "皮肤屏障的建立、胆固醇代谢过程、脱绒毛组织 "等生物学过程（图3c,d）。值得注意的是，在AD病变中，发现了KCs的多种分化轨迹（图3e,f）。尽管发现cluster 4中的炎症和过度增殖基因（SPRR1、SPRR2、S100A7 和 S100A8）也表现出了持续的高表达模式，在GO术语"中性粒细胞介导的免疫，粒细胞趋化的正向调节，肥大细胞趋化"中也有表达（图3g,h）。
图3 角质细胞分化轨迹
3、AD病变中新型炎症分化的IL19+IGFL1+KC亚群
作者聚焦于基底层KC，聚类后使用t-SNE 进行可视化降维描绘了14个细胞簇（图4a），其中基底层KC cluster 5主要包含病变的AD细胞（图4b），其IL19和IGFL1高表达（图4c,d），这在之前的健康KC研究中没有报道过。同时，IL19+IGFL1+KC主要存在于AD病灶中（图4e）。为验证并确定这些IL19+IGFL1+KC的解剖位置，对代表性标记物进行了多重免疫组化。IL19和IGFL1双重染色细胞在棘层中最为显著（图4f），在AD病变中明显多于HC（图4g）。接下来，探讨了IL19在体外的表达和功能。将HaCaT细胞与Der p（100 μg/mL）共培养24小时。通过RT-qPCR，发现Der p可诱导HaCaT细胞产生IL19（图4h）。与PBS相比，在IL19（40 ng/mL）处理的HaCaT细胞中检测到了更高的TSLP mRNA水平（图4i）；然而，KRT10和LOR mRNA水平则出现了下调（图4j,k）。对IL19+IGFL1+KC的DEGs分析显示，Th17轴相关基因（S100A12、DEFB4A和PI3）、高增殖基因（KRT6A、KRT16、NTRK1和EPGN）和S100基因（S100A7、S100A8）高度表达。此外，分析表明，与HCs相比，AD病变中组胺受体（HRH1、HRH2）、allikin释放酶KLK7和整合素相关基因CD47的基因表达大幅上调，而KRT15、CLDN1则下调（图4l）。IL19+IGFL1+KC的DEGs的GO分析显示主要涉及调控凋亡和表皮生长因子受体信号通路，角质形成细胞增殖，髓样细胞和淋巴细胞分化（图4m）。
图4 AD病变中新型炎症分化的IL19 + IGFL1 + KC亚群
4、免疫细胞激活促进免疫微环境重塑
在AD慢性病变中，2型和22型细胞因子IL13、IL22的表达进一步升高，1型和17型细胞因子IFNG、IL26的表达进一步升高。在病变T细胞中，KC分泌分子IL25、IL19和IGFL1的受体分子IL17RB、IL20RB和IGFLR1表达较高（图5a）。GO富集分析显示，T细胞分化增殖、Th1型免疫应答和Th17型免疫应答在病变T细胞中富集（图5b）。因此，scRNA-seq数据证实了记忆/效应1型、2型、17型和22型T细胞在AD慢性病变中的活跃扩增。
在AD病变中，髓系细胞对T细胞的招募和极化起着至关重要的作用。根据先前的研究，AD特异性DCs包括CD1A、FCER1A和MRC1阳性的炎性树突状表皮细胞（IDEC）亚群和一个少量但重要的表达LAMP3（成熟DCs的标记）的细胞亚群，后者以CCL19受体CCR7的强表达而与之区分（图5c）。同样，AD标志性趋化因子CCL17、CCL2222以及TSLP受体成分IL7R也出现了上调（图5d）。GO富集分析表明，DEGs在抗原处理和表达、T细胞分化、活化和迁移方面有显著富集（图5e）。总之，免疫细胞显示出多个炎症基因的失调，并促进了AD病变中免疫微环境的重塑。
图5 AD病变中的免疫细胞激活
5、细胞类型簇中潜在配体-受体相互作用分析
scRNA-seq数据提供了一个独特的机会用来研究由配体-受体相互作用介导的潜在细胞-细胞通讯。在所有细胞的网络图中观察到，KC细胞、T细胞和类髓鞘细胞之间的相互作用最为丰富，这表明KCs和免疫细胞之间的相互作用信号在AD中的重要性（图6a, b）。接下来确定了配体-受体对。AD病变中，IFNG IFNG、IL13、IL26、IL22与各自受体之间的相互作用在T细胞和KC之间的相互作用明显增强。值得注意的是，血管内皮生长因子信号，如VEGFA-KDR、VEGFA-FLT1和NRP2-VEGFA在KCs、骨髓细胞和血管内皮细胞之间发生了改变。配体-受体相互作用分析还预测髓系细胞上的CXCL8和CCL17与血管内皮细胞上的ACKR1有显著的富集相互作用，而ACKR1能介导免疫细胞的迁移，这与之前的研究结果相当一致。AD中髓系细胞与T细胞之间的配体-受体相互作用增强，如CD28-CD86和CTLA4-CD80（图6c,d）。
图6 细胞类型簇中潜在配体-受体相互作用分析
实验方法
采集临床样本，细胞培养和刺激，单细胞样本悬浮液制备，单细胞测序（scRNA-seq）和生信分析，多色免疫组化，RT- qPCR，
参考文献
Zhou J, Liang G, Liu L, Feng S, Zheng Z, Wu Y, Chen X, Li X, Wang L, Wang L, Song Z. Single-cell RNA-seq reveals abnormal differentiation of keratinocytes and increased inflammatory differentiated keratinocytes in atopic dermatitis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023 Jun 16. doi: 10.1111/jdv.19256.