LINC02159通过ALYREF/YAP1信号通路促进非小细胞肺癌进展

       肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。lncRNAs已成为癌症发生和进展的关键调控因子，并成为癌症诊断和预后的有前途的生物标志物。在这项研究中，我们发现了一个新的lncRNA (LINC02159)，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肿瘤组织和血清中表达上调。我们证实，在体外实验中，LINC02159的下调抑制了NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，但诱导了细胞凋亡和细胞周期阻滞，在体内则延缓了肿瘤的生长，而过表达LINC02159则起到相反的作用。我们通过转录组学分析发现LINC02159与肿瘤生长和转移相关通路高度相关，YAP1是LINC02159的潜在靶基因。机制上，LINC02159结合ALYREF，通过m5C修饰增强YAP1 mRNA的稳定性，导致YAP1过表达，激活NSCLC细胞中Hippo和β-catenin信号通路。拯救实验显示，LINC01259以YAP1和ALYREF依赖的方式促进NSCLC进展。综上所述，LINC02159通过调节ALYREF/YAP1信号通路，在NSCLC进展中发挥致瘤作用，具有作为NSCLC诊断标志物和治疗靶点的潜力。本文于2023年8月发表于“Molecular Cancer”（IF=37.3）上。
技术路线

结果
1）LINC02159在非小细胞肺癌中表达上调，与不良预后相关
       为了鉴定NSCLC中失调的lncRNA，我们对来自NSCLC患者的匹配肿瘤组织和邻近非肿瘤组织进行了RNA测序。RNA测序结果显示，与邻近非肿瘤组织相比，肿瘤组织中有84个lncRNA上调，89个lncRNA下调(图1A和1B)。图1C列出了肿瘤组织中上调最多的10个lncRNA。其中，我们选择LINC02159进行进一步研究，因为到目前为止还没有在癌症中进行研究。我们验证了与HBE细胞相比，LINC02159在人NSCLC细胞系(A549、H1299和PC9)中的表达上调(图1D)。然后，我们通过核/细胞质分离和FISH实验检测了LINC02159在NSCLC细胞中的分布，发现LINC02159主要定位于NSCLC细胞的细胞核中(图1E和F)。接下来，我们检测了LINC02159在NSCLC患者配对肿瘤组织和邻近非肿瘤组织中的表达。qRT-PCR结果显示，LINC02159在72%的肿瘤组织中的表达水平高于邻近的非肿瘤组织(图1G)。同时，我们观察到，与肺炎患者和健康人相比，LINC02159在NSCLC患者血清中的表达明显上调(图1H)。NSCLC患者与健康个体的受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.879，敏感性为76.6%，特异性为91.49%，而区分NSCLC患者与肺炎患者的AUC为0.907，敏感性为78.72%，特异性为90.91%(图1I)。我们进一步利用TCGA数据分析了LINC02159的表达，结果也显示了LINC02159在NSCLC患者肿瘤组织中的表达上调(图1I)。综上所述，这些数据表明LINC02159可作为非小细胞肺癌诊断和预后的生物标志物。

2）LINC02159在NSCLC进展中发挥致癌作用
       为揭示LINC02159在非小细胞肺癌中的生物学功能，我们利用特异性siRNA对LINC02159进行了功能缺失研究，并通过qRT-PCR验证了LINC02159在NSCLC细胞中的敲低效率(图2A)。CCK-8和细胞集落形成实验的结果显示，LINC02159敲低显著抑制了NSCLC细胞的增殖(图2B和C)。流式细胞术分析的结果进一步证明，LINC02159敲低在NSCLC细胞中诱导凋亡细胞数量增加和细胞周期阻滞(图2D和E)。此外，western blot结果显示，LINC02159敲低可上调NSCLC细胞中Bax蛋白的表达，下调Bcl-2的表达(图2F)。LINC02159的敲低还抑制了NSCLC细胞的迁移和侵袭能力(图2G和H)。LINC02159的敲低增加了E-cadherin的表达，降低了N-cadherin和Vimentin的表达，以及Slug和Snail等上皮-间质转化(EMT)因子的表达(图2I)。为了进一步验证LINC02159在NSCLC进展中的作用，我们使用对照和LINC02159敲低的NSCLC细胞建立了小鼠皮下移植瘤模型。我们发现，与对照组相比，LINC02159敲低组小鼠肿瘤的体积和重量更小(图2J)。通过Ki-67免疫组化染色和TUNEL染色证实，LINC02159敲低组小鼠肿瘤组织中增殖肿瘤细胞数量减少，凋亡细胞数量增加(图2K)。综上所述，这些结果表明LINC02159在NSCLC进展中发挥致癌作用。

3）LINC02159在NSCLC中与ALYREF蛋白相互作用，并与ALYREF正相关
       为了了解LINC02159在非小细胞肺癌中的致癌作用机制，我们进行了TRAP检测，以鉴定LINC02159相互作用蛋白，因为它已被证明主要定位于细胞核中(图3A-D)。质谱分析结果显示，与MS2组相比，LINC01259-MS2组中有几种蛋白质富集。我们选择ALYREF作为接下来的研究，因为它有最高的折叠变化。我们通过另一个独立的TRAP实验验证了LINC01259与ALYREF的结合(图3E)。RIP实验结果证实，在NSCLC细胞中，LINC02159富集于ALYREF免疫沉淀复合物中(图3F)。免疫荧光染色结果显示，LINC02159与ALYREF在NSCLC细胞核中共定位(图3G)。LINC02159的敲低抑制和过表达增强了ALYREF蛋白的表达，但对其mRNA的影响很小(图3H和3I)。LINC02159敲低导致ALYREF蛋白从细胞核重新定位到细胞质(图3J和3K)。我们随后分析了ALYREF蛋白在NSCLC患者肿瘤和非肿瘤组织中的表达，发现ALYREF蛋白在93%的肿瘤组织中高表达，同时LINC02159水平升高(图3L)。总之，这些发现表明LINC02159可能通过与ALYREF相互作用在NSCLC中发挥促瘤作用。

4）ALYREF在NSCLC中上调并促进NSCLC进展
       ALYREF作为m5C修饰的读取器，调控mRNA加工和核输出。我们首先研究了ALYREF在NSCLC中的表达模式和生物学功能。TCGA数据分析结果显示，与非肿瘤组织相比，ALYREF在NSCLC患者的肿瘤组织中显著上调，AUC为0.882(图4A和B)。生存时间分析结果显示，高水平的ALYREF预示着NSCLC患者的整体预后更差(图4C)。功能缺失研究进一步表明，ALYREF敲低可降低NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞(图4D-K)。ALYREF敲低可上调NSCLC细胞中Bax蛋白的表达，下调Bcl-2的表达(图4L)。ALYREF敲低增加了E-cadherin的表达，降低了N-cadherin和vimentin的表达，以及Slug和Snail等EMT转录因子的表达(图4M)。综上所述，ALYREF在NSCLC中上调，并作为致癌基因促进NSCLC进展。

5）LINC02159通过ALYREF介导的m5C修饰调控NSCLC中YAP1信号
       接下来，我们想知道LINC02159在NSCLC中调控的下游基因和信号通路。RNA测序分析LINC02159敲低的NSCLC细胞中改变的基因。结果显示，与对照细胞相比，LINC02159敲低的NSCLC细胞中有409个基因上调，583个基因下调(图5A和B)。此外，KEGG富集分析结果显示，LINC02159敲低影响了许多与癌症相关的通路，如Hippo、JAK-STAT3和MAPK信号通路(图5C)。我们选择了9个在LINC02159敲低的NSCLC细胞中下调的基因，包括HMGA2、LIN28B和YAP1等。因为这些基因已被证明对癌症的发生和发展至关重要(图5D)。我们关注的是YAP1，因为LINC02159敲低降低了其在NSCLC细胞中的基因表达(图5E)，我们证实，ALYREF敲低降低了NSCLC细胞中YAP1基因的表达(图5F)。Western blot结果显示，LINC02159和ALYREF敲低降低，而LINC02159过表达增加了YAP1蛋白的表达(图5G-I)。既往研究表明，YAP与TEAD转录因子相互作用，激活Hippo通路关键靶基因的表达，包括CTGF、CYR61、AXL、ANKRD1等。因此，我们利用qRT-PCR检测了LINC02159和ALYREF敲低对这些靶基因的影响。结果显示，与对照组相比，LINC02159-、ALYREF-和YAP1敲低组中Hippo通路靶基因的表达显著降低，表明LINC02159通过YAP1调控TEAD活性(图5J、K)。RIP结果显示，在NSCLC细胞中，YAP1 mRNA富集于ALYREF-免疫沉淀复合物中(图5L)。LINC02159敲低降低了ALYREF与YAP1 mRNA的结合(图5M)。此外，LINC02159敲低显著降低了YAP1 3 ' -UTR的m5C水平(图5N)。随后，我们通过Act D实验发现，LINC02159/ALYREF敲低削弱了YAP1 mRNA的稳定性(图5O)。这些结果表明，LINC02159通过ALYREF介导的m5C修饰调控YAP1 mRNA的表达和稳定性。

6）LINC02159通过YAP1/β-catenin轴促进NSCLC进展
       既往研究表明，YAP1不仅作为转录共激活因子参与Hippo通路，而且作为Wnt/β-catenin信号通路的关键调控因子。此外，YAP1还可以调解它们之间的相互串扰。以P < 0.05和fold change > 1.5为过滤条件，KEGG富集分析结果显示，在LINC02159敲低组中，Wnt/β-catenin信号通路显著富集(图6A)。因此，我们研究LINC02159是否也会影响NSCLC中Wnt/β-catenin信号通路的激活状态。Western blot结果显示，与对照组相比，LINC02159和ALYREF敲低组β-catenin、c-Myc和cyclin-D1的表达显著降低，而过表达LINC02159则相反(图6B-D)。为了进一步分析ALYREF、YAP1和LINC02159的相互作用，我们在NSCLC细胞中敲低LINC02159并同时过表达ALYREF。数据显示，ALYREF过表达可以逆转LINC02159敲低导致的YAP1下调(图6E)。然后，我们研究了YAP1的过表达是否可以逆转LINC02159敲低在NSCLC中的作用(图6F)。功能增益和功能损失实验结果显示，LINC02159的敲低明显抑制YAP1的表达和NSCLC细胞的生长、迁移和侵袭，但这种抑制作用可以被YAP1的过表达逆转(图6G-H)。这些结果表明，LINC01259通过YAP1/β-catenin轴促进NSCLC的进展。

结论
       我们首次发现，一种新的lncRNA LINC01259通过与m5C修饰物ALYREF相互作用，提高YAP1 m5C水平和mRNA的稳定性和表达，从而促进NSCLC的进展。我们的研究为非小细胞肺癌提供了潜在的的诊断和预后生物标志物和治疗靶点。

实验方法
FISH，TRAP实验，LC-MS/MS，RNA测序，RIP，体内动物实验，qRT PCR，western blotting，CCK-8，克隆形成实验，transwell，细胞周期和凋亡实验，免疫荧光，RNA稳定实验，生物信息学分析。
参考文献
Yang Q, Wang M, Xu J, Yu D, Li Y, Chen Y, Zhang X, Zhang J, Gu J, Zhang X. LINC02159 promotes non-small cell lung cancer progression via ALYREF/YAP1 signaling. Mol Cancer. 2023 Aug 4;22(1):122. doi: 10.1186/s12943-023-01814-x.