MiR-297通过靶向PTBP3抑制肝癌肿瘤进展

       尽管越来越多的证据表明miR-297有助于肿瘤的发生和进展，但miR-297在肝细胞癌(HCC)中的作用及其潜在的分子机制仍不清楚。在这里，我们报道了在人羊膜上皮细胞(hAECs)条件培养基处理后，miR-297在hepG2细胞中的表达显著增加。而过表达miR-297在体外可抑制HCC细胞系的细胞增殖、迁移和侵袭，在体内可抑制HCC的发生。PTBP3在HCC细胞系中被鉴定为miR-297的直接靶基因，并介导miR-297在HCC细胞中的功能。临床样本中miR-297水平有降低的趋势。体外细胞实验证实，过表达miR-297可通过下调PTBP3表达抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。综上所述，我们的研究结果表明，miR-297可以下调PTBP3的表达，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而阻止HCC的生长、迁移和侵袭。本文于2023年8月发表于“Cell Death Disease”（IF=9.0）上。
技术路线

结果
1）经hAEC-CM处理后，HepG2细胞中miR-297的表达升高
       通过CCK-8和创伤愈合试验评估细胞增殖和迁移能力。用hAEC-CM处理可显著抑制HepG2细胞的生长和迁移(图1A, B)。为了确定生长抑制的机制，我们通过miRNA阵列和RT-qPCR验证了miRNA的差异表达(图1C)。通过miRNA阵列(图1D)和RT-qPCR(图1E)分别检测和验证了miR-297在hepG2中的表达，miRNA阵列的结果显示，miR-297的表达与对照组相比明显增加(图1D)，我们通过RT-qPCR验证了hAEC-CM处理72 h后，miR-297在hepG2中的差异表达。RT-qPCR结果显示，hAEC-CM处理HepG2细胞72 h后，miR297的表达显著升高(图1E)。

2）MiR-297在体外抑制HCC细胞系的增殖、迁移和侵袭
       为了确定miR-297对肝癌细胞体外生长的影响，我们将miR-297模拟物、抑制剂和阴性对照引入肝癌细胞，包括HepG2和Huh7细胞。与阴性对照组相比，转染miR-297模拟物后，肝癌细胞系中miR-297的表达显著升高，而抑制剂处理的肝癌细胞中miR-297的表达显著降低(图2B)。细胞增殖能力通过CCK-8、菌落形成、细胞周期和细胞凋亡检测进行评价。过表达miR-297显著抑制了HepG2和Huh7细胞的生长(图2A)。转染miR-297的细胞在G0/G1期的比例显著高于对照组(图2C)，表明miR-297通过抑制G2到S细胞周期的转变，在G0/G2期阻滞了细胞周期。此外，与对照组相比，转染组形成的菌落数量显著减少(图2D)。我们的结果显示，转染组(miR-297 mimic)和阴性对照组(miR-NC)之间的细胞凋亡没有显著差异(图2F)。转染后，HepG2和Huh7细胞的迁移和侵袭能力降低(图2E, G)。这些结果证实了miR-297在体外抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

3）过表达miR-297可抑制HepG2细胞的体内肿瘤生长
       由于miR-297在体外抑制HepG2和Huh7细胞的生长，我们进行了体内肿瘤形成实验。我们通过裸鼠皮下注射HepG2-miR-297细胞和对照细胞来评估miR-297的体内抗肿瘤功效。每周测量肿瘤体积，肿瘤植入后6周处死小鼠。从第21天开始，miR-297组的肿瘤体积明显低于对照组(图3A)。实验结束时，miR-297组的肿瘤平均重量明显低于对照组(图3B、C)。Ki67的表达弱于对照组的肿瘤(图3D)。这些结果表明miR-397在体内显著抑制肿瘤发生。

4）miR-297在人肝癌患者组织中的表达
       为了研究miR-297在肝癌患者组织中的表达模式，我们进行了组织微阵列。结果显示，miR-297水平在癌组织中与非癌组织相比有降低的趋势，但差异无统计学意义(图4A, B)。并比较四组miR-297表达比例。结果显示四组癌变组织与非癌变组织的比例无显著差异(图4C)。根据p53的表达水平，将70例肝癌患者样本分为p53阳性组和p53阴性组。我们比较了两组，发现阳性组的miR-297水平较低(图4D)。

5）MiR-297靶向并下调PTBP3，抑制PI3K/AKT信号通路
       接下来，我们检索了四个在线miRNA靶点生物信息学预测数据库(TargetScan、PicTar、miRWalk和miRanda)，以确定miR-297的候选靶基因。最初，在所有四个数据库中预测了miR-297的13个潜在基因(图5A)。所有四个数据库都预测PTBP3是miR-297的直接靶点。在PTBP3 mRNA的3 ' -UTR中发现了一个互补的miR-297序列(图5B)。过表达miR-297可下调HepG2细胞中PTBP3 mRNA和蛋白水平(图5C, D)。为了验证PTBP3是miR-297的真正下游靶点，我们进行了双荧光素酶报告基因实验。结果表明，转染miR-297模拟物显著降低PTBP3荧光素酶报告基因活性(图5E)，而miR-297抑制剂具有相反的效果(图5F)。然而，当与突变的PTBP3报告基因共转染时，miR-297模拟物并没有抑制PTBP3的荧光素酶活性。结果强调了miR-297与PTBP3-3 ' -UTR的结合。
       先前的报道表明，PTBP3在HCC中的作用很可能与Akt的磷酸化有关。为了验证，通过western blotting检测AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的表达。我们发现miR-297模拟处理导致miR-297升高，但降低PTBP3、p-PI3K、AKT和p-AKT的表达以及p-AKT/ AKT比值；转染PTBP3质粒后，PTBP3、p-PI3K、AKT、p-AKT表达增加，p-AKT/AKT比值增加。相对于miR-297 mimic处理，miR-297 mimic+PTBP3质粒处理对miR-297的表达没有影响，但增加了PTBP3、p-PI3K和p-AKT的表达以及p-AKT/AKT比值(图5D)。这些结果表明miR-297可以特异性结合PTBP3-3 ' -UTR下调PTBP3表达，从而抑制PI3K/AKT信号通路。我们还对EMT相关基因进行了western-blot分析。我们发现miR-297过表达下调PTBP3、间质标记物(N-cadherin和Vimentin)，但增强上皮标记物(E-cadherin)，而PTBP3质粒转染导致PTBP3、N-cadherin和Vimentin表达增加，但降低E-cadherin表达(图5D)。MiR-297模拟物+PTBP3质粒处理恢复了EMT相关水平。综上所述，PTBP3过表达诱导HepG2和Huh7细胞发生EMT。miR-297在HCC细胞中的过表达可以通过下调PTBP3的表达来抑制EMT。

6）PTBP3表达降低可阻断PI3K/AKT信号通路，抑制肝癌细胞系体外增殖、迁移和侵袭
       在确认PTBP3是HepG2细胞中miR-297的直接靶点后，我们进一步探讨了miR-297介导的PTBP3在HCC生物学功能中与PI3K/AKT信号通路的关系。我们首先将si-PTBP3和阴性对照(si-NC)转染HepG2细胞，以确定PTBP3的减少是否能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。结果表明，转染si-PTBP3可抑制HepG2细胞的增殖(图6A)、迁移(图6C)和侵袭(图6D)。细胞周期阻滞在G0/G1期(图6B)。为了进一步证实PTBP3在miR-297对HepG2细胞抑制作用中的作用，我们将miR-297模拟物和PTBP3质粒共转染到HepG2细胞中，以确定PTBP3过表达是否可以逆转miR-297过表达对HepG2细胞进展的抑制作用。结果表明，PTBP3过表达逆转了miR-297过表达对HepG2细胞增殖(图6E)、迁移(图6G)和侵袭(图6H)以及细胞周期阻滞效应(图6F)的抑制作用。
       此外，miR-297 mimic处理后，HepG2和Huh7细胞中p-PI3K、p-AKT和PTBP3的表达以及p-AKT/AKT比值均降低，而在miR-297抑制剂处理的HCC细胞中观察到相反的趋势。此外，相对于miR-297抑制剂治疗，进一步LY294002治疗不影响PTBP3表达，但导致HepG2和Huh7细胞中p-PI3K和p-AKT表达以及pAKT/AKT比值下降，而miR-297抑制剂+ si-PTBP3治疗导致p-PI3K、p-AKT和PTBP3表达降低(图6I)。CCK-8检测发现，在第3天和第4天，miR-297抑制剂诱导细胞生长，而LY294002或miR-297模拟治疗导致相反的趋势；与抑制剂处理相比，miR-297抑制剂+ si-PTBP3或miR-297抑制剂+ LY294002处理抑制了HCC细胞系的细胞增殖(图6J)。此外，miR-297抑制剂诱导HCC细胞的侵袭和迁移，而LY294002或miR-297 mimic转染则导致相反的趋势；相对于miR-297抑制剂治疗，miR-297抑制剂+ si-PTBP3或miR-297抑制剂+ LY294002治疗抑制HCC细胞的侵袭和迁移(图6K, L)。综上所述，这些结果支持miR-297过表达通过降低PTBP3，抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

结论
       我们证明过表达miR-297在体外抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，在体内抑制肝癌细胞的肿瘤发生。在肝癌细胞中发现PTBP3是miR-297的直接靶基因。MiR-297可直接靶向PTBP3，灭活PI3K/AKT信号通路，抑制HCC细胞系的生长、迁移和侵袭。因此，miR-297可能是一个有效的潜在肝癌治疗靶点。

实验方法
RT-qPCR，Western blotting，荧光素酶报告试验，CCK-8，克隆形成实验，流式，伤口愈合及侵袭试验，裸鼠体内肿瘤发生实验，miR-297原位杂交，免疫组织化学染色，miRNA芯片分析。
参考文献
Lu N, Min J, Peng L, Huang S, Chai X, Wang S, Wang J. MiR-297 inhibits tumour progression of liver cancer by targeting PTBP3. Cell Death Dis. 2023 Aug 26;14(8):564. doi: 10.1038/s41419-023-06097-0.