tRF-Gln-CTG-026减少全局蛋白合成以改善肝损伤
tRNA来源的小RNA（tsRNAs）是压力应激的产物，对应激反应和损伤调节有相当大的影响。然而，tsRNAs是否可以改善肝损伤仍不清楚。在这里，本研究证实tsRNA可改善肝损伤通过利用NSun2的缺失作为tsRNAs发生模型。机制上，NSun2的缺失降低了tRNAs的m5U修饰和m5C修饰，导致产生大量的tsRNAs，特别是tRF-1s类。通过进一步筛选，作者发现tRF-Gln-CTG-026（tG026）是最佳的tRF-1，它通过削弱TSR1（pre-rRNA加工蛋白TSR1同源物）与pre-40S核糖体之间的关联，抑制全局蛋白合成，从而改善肝损伤。本文于2023年4月发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》IF:39.3期刊上。
技术路线
主要实验结果
1、在体外构建loss-of-NSun2作为tsRNA发生模型以缓解损伤
首先对小鼠进行肝损伤诱导，验证tsRNAs是否参与肝损伤和修复（图1a）。结果发现肝损伤小鼠中tsRNA的数量增加（图1b），表明tsRNA的产生与肝损伤有关。为进一步研究tsRNA与肝损伤的关系，建立tsRNA生成模型。通过筛选HL-7702细胞系中的三种tRNA修饰酶（NSun2、Mettl1和Dnmt2），在低损伤胁迫下，与ME-KD（Mettl1敲低）和DN-KD（Dnmt2敲低）相比，NSun2敲低（NS-KD）可导致增殖增加（图1c, e）；此外，在高（致死）应激下，NSun2敲低可提高细胞存活率（图1d, e）。NS-KD也增加了H2O2处理下的细胞增殖（图1f）。相反，使用不同的高强度应激诱导剂（CCl4、对乙酰氨基酚和油酸混合物）并测量细胞存活率。结果显示，NS-KD提高了应激损伤下的细胞存活率(图1g, i)。正如预期的，NS-KD仅在压力下起作用，在基础条件下，NS-KD不影响细胞增殖（图1h, i）。总之，这些结果表明，肝损伤与tsRNA的产生有关，NS-KD可促进细胞增殖和存活，但不会改变体外压力下的细胞迁移。
图1 NS-KD改善细胞损伤。
2、NS-KD在体内改善肝损伤
如上所述，NSun2的缺失是研究tsRNAs的一个合适模型，可以改善细胞在应激下的增殖和存活。因此，作者通过CRISPR/Cas9介导的NSun2基因第2外显子56 bp的缺失，产生了NS-KO小鼠（图2a）。在没有应激损伤的情况下，NS-KO没有引起肝脏形态学和病理生理的异常（图2b），这表明NS-KO和由此产生的tsRNAs在没有应激的情况下都没有功能。通过腹腔注射(i.p) CCl4模拟短期或长期肝损伤（图2c），证明NS-KO对应激损伤和肝损伤有反应。单次注射CCl4后第3天，肝脏出现坏死和炎症；第27天，观察到纤维化；NS-KO小鼠的坏死程度低于野生型小鼠（图2d）。随后检测了单次或多次注射CCl4后的血液生化指标。丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）浓度在单次注射CCl4后第3天达到最大值，表明肝细胞损伤相当严重，随后在重复注射CCl4后第27天降至相对正常水平；NS-KO小鼠的3项指标均低于WT小鼠，提示NS-KO小鼠肝损伤轻微（图2e, f）。此外，与WT小鼠相比，NS-KO小鼠在肝损伤第3天增殖肝细胞数量明显增加（图2g）；相反，NS-KO小鼠的干细胞凋亡显著下降（图2h）。在应激状态下，促增殖、促生存和抗炎相关基因的表达增加，而抗增殖、抗生存和抗炎相关基因的表达受到抑制（图2i）。总之，在短期和长期肝损伤中，观察到NS-KO小鼠的肝损伤比WT小鼠轻，表明NSun2缺失可减轻体内肝损伤。
图2 NS-KO改善肝坏死、再生和活体存活
3、NS-KO衍生的小RNA可改善应激下的增殖和存活
作者假设，NS-KO可通过NS-KO衍生的小RNA防止肝损伤。为验证这一假设，首先敲除HL-7702细胞系中的NSun2，将没有酶活性的突变体NSun2（K190M或C271A）转染到HL-7702细胞系中，并细胞毒性刺激。EdU和细胞增殖实验表明，只有WT NSun2能抑制NSun2敲除引起的细胞增殖促进（图3a、b、d），而NSun2突变体（K190M或C271A）不能。同样，只有WT NSun2 能逆转NS-KD引起的细胞活力增加，而NSun2突变体则不能（图3c, d）。这些结果表明，NSun2的缺失主要通过tRNA甲基转移酶活性的丧失来促进细胞在胁迫下的增殖和存活。在NS-KO细胞中，tRNA表达降低(图3e)。变异最显著的修饰是tRNA m5U和之前描述的m5C，在NS-KO样本中，两者都显著降低（图3f, g）。
上述发现表明，NS-KO通过失去其甲基转移酶活性，同时减少tRNA m5U和m5C修饰来发挥作用。随后研究NS-KO衍生的小RNA是否足以改善细胞在压力下的增殖和存活。从WT和NS-KO小鼠体内分离出14-50 nt和50-100 nt的肝脏RNA片段（图3h）。由于tsRNAs的大小通常小于50 nt，所以将14-50 nt的RNA视为含tsRNAs的RNA，将50 - 100 nt的RNA视为非tsRNAs和阴性对照。EdU表明，转染NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段比转染WT小鼠的片段更能促进细胞增殖（图3i），而50 - 100 nt的RNA不改变两组的增殖。CCK-8实验显示，来自NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段，而不是来自WT小鼠的14-50 nt RNA片段和来自两种小鼠的50-100 nt RNA片段，增加损伤后的细胞存活率（图3j）。因此，NS-KO来源的14-50 nt RNA片段在促进损伤后细胞增殖和存活方面发挥了重要作用。
图3 NS-KO衍生的tsRNAs减轻肝损伤
4、tRF-1是NS-KO的核心产物
为全面分析tsRNAs的代谢特征，分析WT和NS-KO小鼠不同应激损伤后tsRNAs的差异，tsRNA-seq鉴定到841个未记录的tsRNA和104个记录在tRFdb数据库中的已知tsRNA（图4a）。NS-KO小鼠的tsRNAs在整个损伤过程中保持相对较高的水平，而tsRNAs在WT D3时达到峰值（图4b）。因此，作者猜想在整个CCl4重复注射过程中，第3天是肝细胞增殖和tsRNA生成最活跃的时间（图2g, 4b），NS-KO小鼠可能具有与WT D3小鼠相似的“促修复tsRNA模式”。
在进一步分析WT和NS-KO小鼠肝损伤不同阶段的tsRNAs图谱后，发现与其他tsRNAs相比，NS-KO小鼠的tRF-1s突然增加。在所有肝损伤时间点，NS-KO组的tRF-1s都明显多于WT组，但WT组只在第3天有所增加（图4c，d）。对tRF-1s的详细分析显示，tRF-1s的长度主要在14到23 nt之间（图4d）。总的来说，NSun2缺失主要在肝脏中产生14-23 nt的tRF-1s。此外，NS-KO小鼠的tRF-1表达高于WT小鼠，而其他类型的tsRNAs在NS-KO小鼠中的表达低于WT小鼠（图1e）。总之，tRF-1是NS-KO阻止肝损伤和响应压力应激的核心产物。
图4 tsRNA-seq显示应激条件下WT和NS-KO小鼠中tRF-1的特征
5、筛选的tRF-1在体外和体内对肝损伤有拯救作用
如上所述，肝损伤的副产物主要是tRF-1s。为阐明tRF-1s是否可以作为治疗肝损伤的一种潜在方法，人工合成了图4所示的68个tRF-1s。用硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲基（2'-OMe）和胆固醇修饰tRF-1s，以提高其稳定性和体内转染效率（图5a）。然后，将人工合成的 tRF-1s 转染到HL-7702细胞和原代人类肝细胞（PHH）中，并在体外和体内验证它们的功能。EdU试验表明，合成的tRF-1s能促进细胞增殖（图5b）。CCK-8检测显示，过表达tRF-1s后细胞活力提高（图5c）。在PHH中，也得到了一致的结果（图5d，e）。为验证改良合成的tRF-1s在体内的功能，给肝损伤小鼠静脉注射tRF-1s。首先，选择了一种tRF-1（tRF-Met-CAT-049）来测定小RNA在体内的代谢时间过程。结果显示，tRF-Met-CAT-049在注射后第1天开始表达，第3天达到峰值。因此，只注射一次tsRNAs就治愈了肝损伤小鼠（图5f-i），因为注射的RNAs可以在这段时间内保持高水平表达。之后，进一步从68个潜在的tRF-1中筛选出最有效的tRF-1。作者发现，筛选到的tG026在体内可以改善肝损伤（图5j, k），NS-KO后tG026的表达增加（图5l, m）。综上所述，通过筛选，tG026可以改善上述肝损伤。
图5筛选的tG026促进了损伤后细胞的增殖和存活
6、tG026抑制TSR1与18S rRNA的相互作用以降低全局蛋白质合成
为探索tG026的潜在机制，进行RNA pull-down-LC-MS/MS检测，以筛选与tG026相互作用的蛋白质（图6a）。在寻找HL-7702和AML12细胞系中与tG026 相互作用的共同蛋白后（图6b），选择参与Pre-40S核糖体组装的前rRNA处理蛋白TSR1同源物（TSR1）进行后续实验。作者推测tG026可能会调控核糖体。通过RNA pull-down，验证了TSR1和tG026在两种细胞系中的相互作用（图6c，d）。tG026抑制TSR1与核糖体之间的相互作用，因为18S rRNA是核糖体复合物的重要组成部分（图6e, f）。最后，OP-Puro incorporation 实验证实tG026抑制全局蛋白质合成（图6g, h）。
图6 tG026抑制TSR1与18S rRNA的相互作用以降低GPS
总而言之，缺失NSun2可减轻注射CCl4对肝脏造成的损伤。机制上，NSun2 的缺失会减少m5U和m5C的修饰。因此，tRNA变得不稳定并产生tsRNA，尤其是tRF-1。通过进一步筛选实验，发现tG026通过与TSR1相互作用，抑制了TSR1与18S rRNA之间的关联，从而减少了全局蛋白质合成，减轻肝损伤。
图7 tG026参与肝损伤的机制模型。
实验方法
肺损伤小鼠建模，转染，细胞增殖实验，细胞活力实验，WB，划痕实验，HE染色，免疫荧光，免疫组化，qRT-PCR，天狼星红染色，LC-MS检测tRNA修饰，small RNA测序，人工合成tsRNA和体内注射，肝部分切除术（PH），RNA pull-down，蛋白组学分析，RIP，体外和体内检测蛋白总体水平
参考文献
Ying S, Li P, Wang J, Chen K, Zou Y, Dai M, Xu K, Feng G, Zhang C, Jiang H, Li W, Zhang Y, Zhou Q. tRF-Gln-CTG-026 ameliorates liver injury by alleviating global protein synthesis. Signal Transduct Target Ther. 2023 Apr 3;8(1):144. doi: 10.1038/s41392-023-01351-5. PMID: 37015921; PMCID: PMC10073094.