单细胞分析+m6A 狙击 结直肠癌肿瘤微环境

摘要
       N6甲基腺苷（m6A）RNA甲基化在各种癌症的关键遗传事件中都发挥着关键作用；然而，m6A如何在肿瘤微环境（TME）中发挥作用仍诱导阐明。通过非阴性机制因子分解（NMF）分析了来自33例CRC肿瘤样本的单细胞scRNA-seq数据中的65362个单细胞，其中23个m6A RNA甲基化调节因子。使用来自公共储存库的CRC和免疫治疗队列来确定TME集群的预后和免疫反应。将成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞分别分成4-5个不同的亚簇，然后根据不同生物学的过程和不同的标记基因进行分类。此外，它揭示m6A RNA甲基化调节因子可能与CRC的临床和生物学特征以及主要TME细胞类型的拟时间轨迹有显著关系。批量测序分析表明，这些m6A介导的TME细胞亚群对CRC患者具有显著的预后价值，特别是对接受ICB治疗的患者具有显著的免疫应答。
结论
       总之，作者的研究首次揭晓了m6A甲基化介导肿瘤微环境的细胞间通讯在调节肿瘤生长和抗肿瘤免疫调节过程中的作用。
       本研究于2022年5月发表于《Journal of Translational Medicine》上，IF=7.4。
技术路线

结果
1、m6A调节因子在CRC TME细胞中的景观
       总体而言，CRC的scRNA-seq数据集，如前描述的那样，被用于探索m6A RNA甲基化调控子景观（图1A）。SMC数据集包含来自23位CRC患者的33个样本中的65362个TME细胞，其中标注了主要细胞类型，包括上皮细胞、肥大细胞、骨髓细胞、基质细胞、T细胞和B细胞（图1B）。细胞通讯分析展示了这些细胞类型之间存在多种不同的相互作用（图1C）。在这里，作者利用Seurat的Average Expression函数，充分评估了m6A调节因子的平均RNA表达与CRC样本中常见变量之间的显著差异，例如类别类型（正常vs肿瘤），MSI状态（MSI-H vs. MSS），年龄组（Old >60 vs young <=60岁），AJCC分期（I、IIA、IIIA、IIIB、IIIC和IVA）和性别（女性）。显然，SMC数据集中CRC的六种细胞类型中m6A调节因子的表达确实不同（图1E）。热图也显示了m6A调节因子在33个CRC样本中主要细胞类型百分比的差异表达（图S1A）。而且，为评估m6A调节因子与TME细胞免疫状态的关系，作者使用“estimate”R包，评估了65362例CRC TME细胞的ImmuneScore。在6中TME细胞类型中，作者使用ImmuneScore发现写入器和擦除器调节因子之间存在不同的强关联（图S1B）。
       最后，图1F分别利用scRNA数据中23个m6A调节因子的表达，显示了感兴趣的四种细胞类型（成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞）的m6A特殊NMF簇的比例。

图1 m6A RNA甲基化调控因子在结直肠癌单细胞数据中的概述

图S1

2、新型m6A介导的成纤维细胞有助于CRC的TME
       CRC数据集中的机制细胞可分为CRC肿瘤和正常组织中的成纤维细胞和非成纤维细胞（图S2A）。作者将TCGA-COAD和TCGA-READ合并为一个数据集，使用xCell算法计算成纤维细胞的肿瘤浸润情况，它们的高丰度表明CRC患者预后较差（图S2C）。同样，拟时间分析显示，m6A RNA调节因子在TME细胞（包括成纤维细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞等）的轨迹过程中起着关键作用（图2A，图S2D, S3）。因此，通过细胞通讯分析，作者发现这些m6A相关的成纤维细胞簇（命名为核不均一核糖核蛋白A2B1+CAF-C1（n=1939）），WTAP+CAF-C2（n=245），HNRNPC+CAF-C3（n=1194）和NoneMethy-CAF-C4（n=84）与上皮细胞之间存在不同数量的配体受体链接（图2B，图S2E）。其中，WTAP+CAF-C2群体在肿瘤样本（n=1501）中的比例高于正常样本（n=1961 ,卡方检验p < 0.001）（图2C）。KEGG富集分析显示，WTAP+CAF-C2细胞群表现出IL-17活性、TNF信号和基于DEGs的中性粒细胞相关功能。作者还计算了来自先前研究的Pan-CAF签名，发现WTAP+CAF-C2评分与炎性CAF（paniCAF）密切相关（图2E）。
       基因调控网络分析显示，26个转录因子（TFs）的表达在4个聚类中存在显著差异。值得注意的屙屎，REL的TFs，CEBPB、FOSL1、POU2F2、NFKB1、IRF1和ETS1在WTAP+CAF-C2簇中上调（图2F）。作者还比较了四种m6A介导的CAF中一些表面蛋白基因的表达，发现CD34、LRRN3、BAMB1、P2RY6、CLDN1和ICAM1在大鼠WTAP+CAF-C2组中升高（图S2F）。从途径热图可以看出，WTAP+CAFC2和NoneMethy-CAF-C4在这些途径基因的表达上存在显著差异。最后，富集图谱显示HNRNPA2B1+CAF-C1、WTAP+CAF-C2和NoneMethy-CAF-C4具有不同的REACTOME通路特征（图2H）。

图2 m6A调节因子改变成成纤维细胞的特征

图S2

图S3：伪时间轨迹分析热图，结直肠癌TME主要细胞类型中的TME细胞亚型包括巨噬细胞、B细胞以及四种T细胞（CD8+T、CD4+T、Treg、NK）

T细胞）。

3、m6A介导的巨噬细胞的经典特征
       骨髓细胞共提取巨噬细胞5822个，分为肿瘤相关巨噬细胞（5586个）和正常巨噬细胞（236个）（图S4A）。然后，作者获得5个主要的m6A-mac集群（图S4B, C），包含4个集群表达m6A调节因子（WATP+mac-C1，n=1432；HNRNPC+mac-C2，n=442）和一个不表达m6A调控因子的集群（NoneMethy-mac-C5，n=241）（图3A）。m6A-mac NMF簇的平均数量和细胞比例在正常和肿瘤之间有显著差异（卡方检验p < 0.001，图S4D）。与成纤维细胞类似，作者也观察到这些m6A相关巨噬细胞簇与肿瘤上皮细胞之间存在不同数量的配体受体连接。
       接下来，对这些signatures使用Seurat的AddModulScore函数（图3B,C，图S4E, F），在TAMs中，作者发现WTAP+macC1与促炎巨噬细胞显著相关，HNRNPA2B1+mac-C3与SPP1+和C1q+巨噬细胞显著相关。检查点在5个m6A-mac集群中的表达也有显著差异（图S4G）。此外，巨噬细胞的SCENIC分析显示，WTAP+mac-C1和HNRNPA2B1+mac-C3簇对潜在TF的激活不同（图3D）。
       为评估作者的m6A-mac集群和特殊途径之间的关系，作者使用GSVA，检测到113个代谢途径仲有1个在5个m6A-mac集群之间存在显著差异（图3E）。然后，50个标志通路在5个集群通路中显示出广泛不同的活动（图S4H）。富集图还显示WTAP+mac-C1、HNRNPA2B1+mac-C3和TTHDC1 & YTHDF3+mac-C4具有不同的REACTOME通路特征（图3F）。

图3 m6A调节因子有助于5822肿瘤相关巨噬细胞的产生

图S4：CRC中m6A-mac集群的特性

4、m6A介导的T/B细胞表型强调CRC的抗肿瘤免疫应答
       总共检测到23115个T细胞，鉴定到CD4+、CD8+、Treg、NK、T helper 17、T follicular helper等8种主要细胞类型并进一步分析（图4A）。NMF算法共识别出5个与m6A相关的细胞簇，命名为methy-T-C1至methy-T-C1（图4B），这些m6A相关的T细胞簇与肿瘤上皮细胞之间存在不同数量的配体受体连接（图4C）。检查点表达分析也显示这些m6A相关T细胞簇之间的表达有显著差异（图S5A）。网络调控分析显示，TFs在这些m6A T细胞簇中的表达存在显著差异（图4D）。此外，为评估T细胞中与m6A相关的T细胞簇，作者发现共刺激、共抑制免疫基因和一些功能相关标记物的平均表达存在许多差异。作者还发现CD4+T、CD8+T、Treg和NK T细胞的m6A细胞簇中特征的平均表达存在许多差异，包括T衰竭评分、T细胞毒性评分、T效应评分和T逃避评分（图4E）。同样，根据差异表达基因（DEGs），富集图谱显示CD8+T-C1、Treg-C1、CD8+T-C4和Treg-C4有更多的免疫功能相关条目（图S5B）。对于9146个B细胞，NMF m6A簇与上皮细胞具有相似的配体受体连接。M6A相关B细胞组分别与IgG浆B细胞、IgA+浆B细胞、CD19+CD20+B细胞无显著关系（图4F-H）。然而，热图仍然显示了m6A集群之间显著不同的TFs（图4I）。

图4 T细胞和B细胞m6A甲基化调节因子的NMF簇

图S5：结直肠癌中m6A-T细胞群的免疫特征及预后

5、m6A介导的TME模式有助于结直肠癌的预后和免疫治疗
       为获得主要CRC TME细胞类型的特征，作者重新计算了它们在CRC scRNA数据中的DEGs，并提取了前30个作为细胞标记。然后，根据m6A介导的TME细胞的所有DEGs，作者使用GSVA计算m6A亚评分，并通过对来自8个和11个CRC队列的1892例和2315例CRC患者的OS和RFS进行meta分析，分别探讨其在CRC患者和泛癌中的预后，如图5所示。将所有评分分为两组进行cox回归分析。有趣的是，随着特殊m6A介导的亚细胞类型中主导m6A基因的变化，作者发现它们的无复发生存期（图5A）和总生存率（图5B）在这些亚群中有显著差异，包括CAF、巨噬细胞、CD8+T、Treg和B细胞。此外，作者使用逻辑回归方法观察m6A sub TME细胞的相同有意义的现象，以预测13个公共癌症队列（肾透明细胞癌，非小细胞肺癌，恶性黑色素瘤，黑色素瘤，尿路上皮癌和膀胱癌）中经历过免疫治疗的病人的免疫反应（图5C）。最后，作者考察了附加文件2：图S6A和B中列出的泛癌症患者中m6A亚簇的预后，发现不同的细胞亚簇贡献了不同的癌症，具有显著的预后。

图5 m6A相关细胞类型（GSVA评分）的总体预后和免疫治疗反应，来源于公共队列的大容量序列。采用survival R包计算cut-off值

图S6：Pan癌症患者中m6A相关亚型TME细胞预后的动态影响

6、m6A介导的TME模式增强了细胞间通讯
       通过细胞通讯分析，作者列出了细胞间通信的所有配体-受体对，包括MIF−（CD74+CXCR4）、MIF−（CD74+CD44）、MDK-NCL、LGALS9−CD45, CLEC2D−KLRB1、CLEC2C−KLRB1、CLEC2B−KLRB1、APP−CD74、CD99−CD99和ADGRE5−CD55，从m6A亚簇到肿瘤上皮细胞均存在（图6A）。在这里，图6B证明了两者之间潜在机制的假设。每种m6A亚型可能与肿瘤上皮簇具有不同的强度和配体受体对，这表明m6A介导的TME细胞可能与肿瘤细胞有更多的相互作用，从而促进CRC的进展。

图6 从主要的m6A相关TME细胞到上皮细胞的细胞间通讯

实验方法
scRNA-seq，TCGA数据库和GEO数据库挖掘， Seurat 包可视化CRC中TME细胞类型和细胞亚型，TME细胞m6A mRNA调控因子的拟时间轨迹分析，TME细胞中m6A mRNA调控因子的非负性基质因子分解，TME细胞中m6A相关细胞亚型标记基因的鉴定，KEGG和Reactome通路分析（clusterProfiler R包），GSVA，SCENIC分析，细胞通讯分析，m6A相关特征的生存分析
参考文献
Gao Y, Wang H, Chen S, An R, Chu Y, Li G, Wang Y, Xie X, Zhang J. Single-cell N6-methyladenosine regulator patterns guide intercellular communication of tumor microenvironment that contribute to colorectal cancer progression and immunotherapy. J Transl Med. 2022 May 4;20（1）:197. doi: 10.1186/s12967-022-03395-7. PMID: 35509079; PMCID: PMC9066909.
关键词
单细胞，m6A，肿瘤微环境，结直肠癌，预后，免疫治疗