胃癌中索拉菲尼诱导铁死亡实锤——ATF2

       索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，在包括胃癌（GC）在内的多种癌症中作为铁死亡诱导剂具有重要的抗肿瘤作用。然而，索拉非尼作为铁死亡诱导剂的作用最近受到了质疑。有关铁死亡与ATF2关系的信息非常有限，而ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的作用也尚未研究。因而，本研究探讨了GC中ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的作用及其分子机制。作者发现索拉非尼激活ATF2的表达，并进一步促进HSPH1的表达，减少SLC7A11蛋白的降解，从而导致对脂质过氧化的保护。在小鼠中，敲除ATF2能有效提高索拉非尼的敏感性。本文于2023年2月发表在《Redox Biology》IF: 11.4期刊上。
技术路线

主要实验结果
1、ATF2在胃癌中表达上调，预示预后不良
       TCGA数据显示ATF2在胃癌组织中的高表达（图1A），ATF2在GC细胞系中的表达也显著高于非恶性细胞系（图1B），在12对临床样本中，ATF2在胃癌组织中的表达也显著高于癌旁（图1C）。在107例GC组织和22例癌旁组织的GC芯片中检测了ATF2的表达（图1D），61.7%的GC组织高表达ATF2（图1E），并且ATF2高表达的GC患者生存期更短（图1F）。以上表明ATF2在胃癌中表达上调，预示预后不良。

图1 ATF2在胃癌中表达上调，预示预后不良

2、ATF2敲除抑制GC细胞恶性表型
       如图2所示，过表达ATF2促进细胞增殖、迁移和侵袭，敲低ATF2则结果相反。表明ATF2促进GC恶性表型。

图2 ATF2敲除抑制GC细胞恶性表型

3、索拉非尼诱导GC细胞铁死亡并激活ATF2表达
       由于先前的研究表明索拉非尼诱导的铁死亡中存在不确定性，所以作者首先研究了索拉非尼是否会诱导GC细胞的铁死亡。如图3A所示，10 μM索拉非尼作用24 h后，AGS和MGC803细胞形态均缩小、变圆、排列疏松，而与铁死亡抑制剂共同处理可以部分逆转这些变化。与对照组相比，索拉非尼治疗导致总细胞ROS和脂质ROS增加（图3B-3C）。此外，用索拉非尼孵育导致MDA急剧增加而GSH下降，而这种影响被fer-1有效抑制（图3D和E）。以上结果表明索拉非尼诱导GC细胞铁死亡。

图3索拉非尼诱导AGS和MGC-803细胞铁死亡

       鉴于铁死亡与线粒体功能密切相关，接下来检测线粒体膜电位（MMP）和形态学的变化。JC-1染色结果显示，与对照组相比，索拉非尼治疗显著降低MMP（图4A），透射电镜显示，索拉非尼处理的MGC803细胞线粒体嵴明显减少或缺失，线粒体膜密度增加（图4B）。这些结果也表明索拉非尼可以诱导GC细胞的铁死亡。作为一种关键的应激反应转录因子，ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡反应中的表达变化仍然未知。如图4C所示，索拉非尼处理增加ATF2的表达，尤其是磷酸化形式。值得注意的是，免疫荧光显示，索拉非尼刺激后 ATF2 在细胞核中的表达量更高（图4D）。因此，索拉非尼诱导的铁变态反应可能会促进 ATF2 的核转位并增强 ATF2 在 GC 细胞中的转录活性。

图4索拉非尼治疗增加GC细胞中ATF2的表达并促进其核易位

4、ATF2敲除抑制索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡
       如图5所示，为了解ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的作用，作者干预ATF2的表达水平并评估它们对铁死亡的影响。与载体组相比，ATF2过表达导致AGS细胞中索拉非尼的IC50值升高，而ATF2敲低导致MGC803细胞中索拉非尼的IC50值降低（图5A）。索拉非尼治疗和ATF2敲低均升高了细胞总ROS和脂质ROS，ATF2敲低导致AGS细胞中ROS的进一步升高，而ATF2过表达抑制了索拉非尼在MGC803细胞中诱导的升高（图5B-C）。在索拉非尼处理的GC细胞中，ATF2过表达导致MDA降低，GSH升高，而ATF2敲低则显示相反的结果（图5D-E）。TEM结果显示索拉非尼治疗后，ATF2敲低的GC细胞线粒体减少，膜密度增加，嵴退化，这种作用部分被ATF2过表达逆转（图5F）。这些发现表明ATF2过表达抑制索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡。

图5 ATF2敲除抑制索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡

5、ATF2在GC细胞中激活HSPH1的转录
       为进一步阐明其潜在机制，进行RNA-seq和ChIP-seq分析，以确定全基因组的DNA结合位点和ATF2的潜在转录靶点。如图6A所示，RNA-seq分析显示，与对照组相比，MGC803细胞中ATF2基因敲除后，有1059个基因上调，370个基因下调。重要的是，RNA-seq数据的通路富集分析表明，ATF2基因敲除会显著影响铁死亡通路（图6B）。接下来，ChIP-seq共鉴定出24119个峰，对应3641个RefSeq基因，其中2.88%位于启动子-转录起始位点（图6C）。在染色体上观察到了不同的峰值，并扫描了峰值之间共享的motif（图6D和E）。

图6利用RNA-seq和ChIP-seq技术鉴定ATF2的全基因组DNA结合位点和转录靶点

       然后，对RNA-seq和ChIP-seq数据进行交叉分析，筛选出222个ATF2直接调控的候选转录靶点（图7A）。其中，HSPH1在ATF2敲低后显著下调（图7B）。此外，在TCGA数据集中，HSPH1在GC中的表达与ATF2呈显著正相关（图7C）。如图7D所示，ChIP-seq数据显示HSPH1启动子区域存在显著的ATF2结合峰。因此，作者推测HSPH1可能是ATF2的潜在靶基因。WB分析结果显示，ATF2过表达后，HSPH1增加，而ATF2敲除后，HSPH1减少（图7E）。此外，ChIP-qPCR进一步证实ATF2可与HSPH1的启动子区域结合（图7F）。这些数据表明ATF2可以通过与HSPH1启动子结合来激活HSPH1的表达。

图7 ATF2结合HSPH1启动子激活其转录

6、HSPH1与SLC7A11在GC中相互作用并增加其稳定性
       鉴于多项研究报道了热休克蛋白在铁死亡反应中的突出作用，作者试图确定 HSPH1是否会影响SLC7A11在GC中的表达。首先查询GeneMANIA数据库，预测并显示HSPH1与SLC7A11之间潜在的相互作用（图8A）。为验证这一预测，进行co-IP实验，确定HSPH1与SLC7A11存在物理相互作用（图8B）。采用siRNA敲除HSPH1的表达（图8C），并将HSPH1 siRNA转染到ATF2稳定过表达的AGS细胞中。有趣的是，观察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11的蛋白表达水平，但没有降低mRNA水平（图8D）。因此，进行CHX追逐试验，以确定在是否敲除HSPH1的情况下SLC7A11蛋白的半衰期。WB分析表明，与对照组相比，抑制HSPH1会加速AGS细胞中SLC7A11蛋白的降解（图8E）。这些结果表明，HSPH1可以与SLC7A11相互作用，并至少部分地通过增加SLC7A11蛋白的稳定性来增加其表达。敲除HSPH1可部分消除ATF2过表达对细胞ROS和脂质ROS的影响（图8F和G）。同样，联合转染HSPH1 siRNA能显著逆转ATF2过表达对铁变态细胞死亡中细胞MDA和GSH水平的影响（图8H和I）。这些结果为ATF2通过HSPH1调控索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡提供了证据。

图8 HSPH1与SLC7A11相互作用，提高其在GC中的稳定性

7、体内ATF2敲低增加GC对索拉非尼的敏感性
       最后，为评估ATF2单独和联合索拉非尼对体内GC的影响，建立裸鼠异种移植模型（图9A）。稳定ATF2敲除细胞形成的肿瘤始终比对照GC细胞形成的肿瘤更小更轻，这表明ATF2敲除能有效抑制体内肿瘤的生长（图9B）。此外，经索拉非尼治疗后，皮下肿瘤的体积和重量均显著减少（图9C和D）。也就是说，ATF2敲除联合索拉非尼治疗对肿瘤生长的抑制作用最强。为更好地观察潜在的死亡，皮下肿瘤切片被4-HNE染色，IHC染色显示，sh-ATF2 +索拉非尼组的4-HNE 表达量最高（图9E）。因此，ATF2基因敲除可增强索拉非尼在体内对GC的抗肿瘤作用。

图9体内ATF2敲低增加GC对索拉非尼的敏感性

       总之，在本研究中，作者发现索拉非尼激活ATF2的表达，并进一步促进HSPH1的表达，减少SLC7A11蛋白的降解，从而导致对脂质过氧化的保护（图10）。因此，以ATF2/HSPH1轴为靶点来增强索拉非尼诱导的铁死亡代表了一种有吸引力的GC治疗策略。

图10 图像摘要

实验方法
胃癌临床样本采集，细胞培养和转染，WB，RT‒PCR，IHC，细胞生长曲线，IC50检测，Transwell迁移和侵袭，Calcein-AM/PI染色，ROS和脂质过氧化检测，MDA和GSH检测，线粒体膜电位检测，透射电镜TEM，RNA-seq，ChIP-seq，共免疫沉淀（Co-IP），蛋白稳定性CHX实验，小鼠模型，
参考文献
Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2023 Feb;59:102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564. Epub 2022 Dec 2. PMID: 36473315; PMCID: PMC9723522.