全乳酸组揭示实验性自身免疫性葡萄膜炎中TH17分化的乳酸依赖机制
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发布时间：2024-03-08
CD4+ T 细胞分化失调与自身免疫性疾病有关。从氧化磷酸化到糖酵解的代谢重编程以及乳酸的积累都与这一过程有关......
CD4+ T 细胞分化失调与自身免疫性疾病有关。从氧化磷酸化到糖酵解的代谢重编程以及乳酸的积累都与这一过程有关。然而，其潜在机制仍不清楚。本研究表明，乳酸衍生的乳酸化调控CD4+ T 细胞的分化。CD4+ T细胞中的乳酸化水平随着实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的进展而增加。抑制乳酸化可抑制TH17分化并减轻EAU炎症。机制上，Ikzf1在Lys164处的高乳酸化通过直接调节TH17相关基因（包括Runx1、Tlr4、白细胞介素-2（IL-2）和IL-4）的表达，促进TH17的分化。Ikzf1在Lys164处的脱乳作用损害TH17的分化。这些发现例证糖酵解如何调节蛋白质乳酸化的位点特异性以促进TH17分化，并将Ikzf1乳酸化作为自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。该研究于2023年10月发表在《Science Advances》，IF：13.6。
技术路线
主要研究结果
1. EAU小鼠CD4+ T细胞中乳酸化水平升高
建立EAU小鼠模型，并通过裂隙灯摄影和病理检查评估葡萄膜炎的进展。EAU 小鼠的脾脏重量明显增加，但各组间体重无显著差异（图1A-B）。与年龄匹配的对照组相比，EAU 小鼠脾脏和 CD4+ T 细胞中的乳酸含量更高（图1C）。使用免疫磁珠分离CD4+ T 细胞，CD4+ T细胞中的乳酸化水平随着EAU的进展而增加（图1D）。同时，免疫荧光染色显示，EAU小鼠脾脏中CD4+ T细胞的乳酸化水平过高（图1E）。随着葡萄膜炎的发展，病理免疫细胞破坏血液-视网膜屏障，并引发视网膜的破坏性反应。第14天浸润视网膜的CD4+ T细胞乳酸化过度，第21天Pan-Kla阳性的CD4+ T细胞比例下降（图1F）。这些结果表明，乳酸化参与自身免疫性葡萄膜炎中CD4+ T细胞在病理刺激下的免疫反应。
图1. EAU小鼠CD4+ T细胞中乳酸化水平升高
2. 抑制乳酸化作用可抑制EAU的进展
在本研究中，DCA 治疗减少CD4+ T 细胞中乳酸的产生和乳酸化水平（图 2A -B）。它还降低EAU 小鼠的临床和病理评分（图2C -E）。相比之下，用鱼藤酮阻断线粒体代谢会增加 CD4+ T 细胞的乳酸化，加剧EAU的恶化（图2A-E）。第14天，EAU+DCA组（用DCA治疗的EAU小鼠）脾细胞中TH17细胞的比例下降，而EAU+鱼藤酮组（用鱼藤酮治疗的EAU小鼠）脾细胞中TH17细胞的比例上升。然而，EAU+DCA组和EAU+鱼藤酮组之间的TH1和Treg细胞比例没有发现明显差异（图2F-G）。这些结果表明，调节CD4+ T 细胞的乳酸化水平可影响TH17细胞的分化和EAU的进展。
图2. 抑制乳酸化作用可抑制EAU的进展
3. 乳酸化作用调节体外TH17分化
通过磁性分选分离纯化的naïve CD4+ T 细胞，并单独使用抗CD3和CD28 抗体（TH0条件）或在 IL-6、TGF-β、IL-23 和 IL-1β 存在下（TH17 条件）进行刺激。诱导5天后，使用 FCM 分析细胞质 IL-17 的产生。发现，TH17 条件下CD4+ T细胞的乳酸化水平高于 TH0 条件下的 CD4+ T 细胞（图3A）。DCA 处理下调CD4+ T 细胞的乳酸化水平，抑制TH17 细胞的分化，而鱼藤酮处理上调乳酸化水平，增强TH17 的分化（图3B-C）。使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测分泌型 IL-17，也得到类似的结果（图3D）。这些结果表明，CD4+ T 细胞中的乳酸化对 TH17 的分化非常重要。
图3. 乳酸化作用调节体外TH17分化
4. CD4+ T细胞中乳酸化蛋白的全貌
为研究正常和EAU小鼠CD4+ T细胞上的Kla底物，采用一种包括免疫亲和富集和四维质谱仪的综合方法。从每组10多只小鼠中分离出1×108个CD4+ T 细胞，然后进行裂解。肽用胰蛋白酶消化，用固定的抗 Kla 增强，然后进行液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS；图4A）。乳算化蛋白分布在不同的亚细胞定位中。在细胞核中发现359个乳酸化蛋白（32.28%）；在细胞质中发现448个乳酸化蛋白（40.29%）；在线粒体中发现123个乳酸化蛋白（11.06%）（图4B）。
图4C显示乳酸化赖氨酸残基附近氨基酸的频率变化。Motif-X分析发现 KxAxxxxxxxK是 Kla 位点代表性极高的热点（图4D）。使用 NetSurfP 进行的结构特性分析表明，大多数乳酸化位点位于线圈（67%）和螺旋（28%）中，其余5%位于链中（图4E）。与未乳酸化的残基相比，乳酸化残基更偏向于链状和螺旋状，这表明CD4+ T细胞在结构上更偏向于Kla。图 4F 中的散点图显示Kla 位点与肽强度的量化关系。
图4. CD4+ T细胞中乳酸化蛋白的全貌
5. Ikzf1在 Lys164处的高乳酸化对TH17的分化非常重要
测量CD4+ T 细胞中 Kla 蛋白相对于总蛋白丰度的变化。前15种差异乳酸化蛋白（DLPs）如图5A所示。GO分析显示，乳酸化上调蛋白富集于多个生物过程，包括淋巴细胞分化和基因表达调控（图5B）。图5（C -D）显示包括 Ikzf1 C端y离子和N端b离子在内的MS/MS图谱。观察到对照组和EAU小鼠的 CD4+ T细胞（图5E）之间以及TH0和TH17细胞（图5F）之间的Ikzf1表达没有明显差异。免疫沉淀（IP）检测后的免疫印迹证实，EAU小鼠CD4+ T细胞中Ikzf1的乳酸化水平上调（图5E）。用短发夹RNA敲除内源性Ikzf1，并在naïve CD4+ T细胞中分别过表达Flag标记的野生型（WT）Ikzf1、K164R突变Ikzf1和K373R突变Ikzf1（图5G）。这些细胞被用于诱导TH17。结果显示，敲除Ikzf1 会影响TH17的分化（图5H），表明Ikzf1在调控TH17分化中的重要作用。WT和K373R Ikzf1过表达可挽救TH17的分化，但在oe-K164R组仍观察到较低的分化率（图5H）。这些结果表明，Ikzf1在Lys164 处的乳酸化对TH17的分化非常重要。
图5. Ikzf1在 Lys164处的高乳酸化对TH17的分化非常重要
6. Ikzf1 K164la在EAU小鼠 CD4+ T细胞中上调
为了进一步验证不同条件下Ikzf1在Lys164处的乳酸化水平，开发针对Ikzf1修饰肽[NLLRHI-(lactyl)K-LHSGEK]的特异性抗体。点印迹检测显示，所构建的抗体特异性地靶向Ikzf1的乳酸化肽，而不与未乳酸化的Ikzf1肽结合（图6A）。利用这种特异性抗体，证实在TH17诱导下，CD4+ T 细胞中Ikzf1在Lys164处的乳酸化水平升高（图 6B）。以前曾发现，鱼藤酮处理可提高CD4+ T细胞的Pan-Kla水平并促进TH17分化。在本研究中，发现这一过程伴随着Ikzf1 K164乳酸化的上调，并且乳酸化水平在DCA处理后下降（图6C）。同时，随着EAU的进展，Ikzf1 K164乳酸化上调，并且在体内对鱼藤酮和DCA处理有调节作用（图6D-E）。这些结果进一步表明Ikzf1 K164乳酸化在TH17分化和自身免疫性葡萄膜炎中的关键作用。
图6. Ikzf1 K164la在EAU小鼠CD4+ T细胞中上调
7. CUT& Tag分析揭示Ikzf1在TH17分化条件下的转录后果
进行CUT& Tag分析，以探索CD4+ T细胞中可能受Ikzf1 K164la调控的基因，并研究Ikzf1 K164la在TH17发育中的潜在功能意义。简而言之，用 oe-WT Ikzf1或oe-K164R Ikzf1过表达Ikzf1敲除的naïve CD4+ T 细胞，用于TH17 诱导。诱导5天后，收获细胞进行CUT& Tag分析。CUT& Tag结果显示，在TH17分化条件下，CD4+ T细胞中的Ikzf1峰明显富集，两组中都发现超过15,000个Ikzf1结合峰，其中>60%位于启动子序列（≤3 kb；图7A-B）。GO 分析显示，下调的峰值相关基因富集在多个免疫过程中，包括淋巴细胞分化（图7C）。
具体而言，在TH17分化调控基因（包括IL-2、IL-4、Tlr4和Runx1）的候选基因组位点上发现的调用峰显示，K164R组Ikzf1在这些基因启动子上的富集水平降低（图7D）。意外的是，反转录qPCR（RT-qPCR）结果显示，在sh-Ikzf1 组中，阻止TH17分化的基因，包括IL-2和IL4的表达水平上调，而促进TH17分化的基因，包括Runx和Tlr4的表达水平下调（图7E）。WT和K373R Ikzf1的过表达抑制IL-2和IL-4的表达，并挽救Runx1和Tlr4的表达，但K164R Ikzf1的过表达没有显示出这种效应（图7E）。这些结果进一步证明Ikzf1在Lys164乳酸化调控下的双重转录激活和抑制能力。双荧光素酶报告实验用于验证Ikzf1的不同转录能力。一致的是，Ikzf1敲除会影响Runx1的转录并促进IL-2的转录，WT和K373R Ikzf1overexpression能逆转这种情况，但K164R过表达则不能（图7F-G）。在Ikzf1敲除的naïve CD4+ T 细胞中应用重组抗IL-2抗体。结果显示，抗IL-2处理挽救TH17分化，并上调IL-17的表达（图7H-I）。总之，这些结果表明，Ikzf1在Lys164 处的乳酸化作用通过激活Runx1和Tlr4的转录以及抑制 IL-2和IL4的转录来调节TH17的分化（图8）。
图7. CUT& Tag分析揭示Ikzf1在TH17分化条件下的转录后果
图8. 本研究的示意图
总之，本研究探讨了乳酸化在TH17细胞分化和EAU进展中的潜在作用。描述了CD4+ T细胞的乳酸化图谱，并报告了Ikzf1在Lys164处的乳酸化调节TH17 的分化。此外，还验证了 Ikzf1在TH17相关基因中的双重转录激活和抑制作用，这些基因都受到乳酸化作用的调控。因此，本研究扩大了乳酸化蛋白质组的范围，并证明了以前未被发现的乳酸化作用。
实验方法
EAU的诱导和治疗，体外诱导TH1和TH17细胞，腺病毒感染和质粒转染，免疫荧光染色，HE染色，乳酸水平的定量，Real-time qPCR，WB，免疫沉淀，染色质免疫共沉淀，荧光素酶活性实验，酶联免疫吸附实验，流式细胞术，Pan-Kla-based PTM富集，LC-MS/MS分析和数据库检索，CUT& Tag
参考文献
Fan W, Wang X, Zeng S, Li N, Wang G, Li R, He S, Li W, Huang J, Li X, Liu J, Hou S. Global lactylome reveals lactylation-dependent mechanisms underlying TH17 differentiation in experimental autoimmune uveitis. Sci Adv. 2023 Oct 20;9(42): eadh4655. doi: 10.1126/sciadv.adh4655. Epub 2023 Oct 18. PMID: 37851814.