肠道真菌通过抑制SAA1-GSDMD通路保护肠缺血再灌注损伤
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发布时间：2024-03-12
本发现首次阐明了肠真菌在IIR损伤中发挥着重要作用。预防性抗真菌治疗应该考虑破坏真菌平衡......
背景
预防性抗真菌治疗已广泛应用于危重症患者，但未能改善患者预后，已成为研究热点。这可能与真菌稳态的破坏有关，但真菌的作用机制尚不清楚。肠缺血再灌注（IIR）损伤是危重症患者的常见途径，具有致命性，并受肠道菌群的调节。然而，肠道真菌在IIR损伤中的确切作用尚不清楚。
目的
这是一项临床研究，旨在为阐明IIR损伤的潜在机制提供新的视角，并为未来IIR损伤的预防和治疗提供潜在的策略。
方法
采用ITS测序检测IIR损伤前后真菌的变化。分别用单真菌菌株、氟康唑和甘露聚糖预处理改变肠道真菌的组成。在IIR损伤小鼠模型中评估肠道形态和功能损伤。体外试验培养肠上皮MODE-K细胞和巨噬细胞RAW264.7细胞。
结果
粪便真菌多样性在IIR患者和小鼠中显示出明显的改变，并伴随着肠上皮屏障功能障碍。真菌定植和甘露聚糖补充可通过抑制巨噬细胞SAA1的表达，减少肠上皮细胞焦亡，逆转氟康唑加重的肠道形态和功能损伤。采用liposomal clodronate耗竭巨噬细胞数量，证明甘露聚糖的保护作用依赖于巨噬细胞的参与。
结论
本发现首次阐明了肠真菌在IIR损伤中发挥着重要作用。预防性抗真菌治疗应该考虑破坏真菌平衡。本研究为阐明长真菌在维持肠体内平衡提供了新颖的线索。
本研究于2023年9月发表在《Journal of Advanced Research》上，IF：10.7。
技术路线
主要研究内容
1、IIR损伤患者和小鼠的肠道真菌分布表征
为证实患者的IIR损伤已发生，作者评估了患者在首次血液透析过程中SMA形态和血流量的变化。血液透析2 h后，SMA血流的线性参数和容积参数降低（图1A）。另外，在血液透析前2 h和血液透析后24 h采用ELISA法检测IIR损伤的肠屏障相关生物标志物。观察到I-FABP和ZO-1水平显著增加，但瓜氨酸值在两个时间点之间降低（图1B）。
考虑到肠道真菌在维持肠道屏障稳态中的潜在重要作用，作者在IIR损伤前（Before）和IIR损伤后（After）两个时间点收集了IIR损伤患者的粪便样本。然后，选取配对的粪便样本，使用ITS测序探索真菌的多样性、丰富度和组成。不同的alpha多样性指数包括Chao，Shannon和Shannoneven显示出相似的趋势，表明微生物组样品内的多样性差异显著（图1C）。同样，微生物组样品之间的多样性（β多样性）显示，两个聚类相对分离，表明两组之间的真菌结构存在差异（图1D）。此外，两组均进行了目和属水平的检测，发现Saccharomycetales和Candida显著降低（图1E）。作者通过LEfSe分析从门到属水平探究物种特征（LDA > 4），同样发现Saccharomyces的丰度显著降低（图1F）。进一步，作者评估了真菌丰度与IIR损伤的肠道屏障相关生物标志物之间的相关性。假丝酵母和Saccharomyces相对丰度与瓜氨酸水平呈正相关，与I-FABP和ZO-1水平呈负相关（图1G-H）。
为获得IIR损伤和肠真菌的直接相关性，作者在消除血液透析过程中其他因素影响的同时，建立了IIR小鼠模型，收集损伤前和损伤后的粪便并进行ITS测序。在属水平上的Alpha多样性分析显示两组之间没有差异（图1I），而与损伤前小鼠相比，IIR小鼠的Beta多样性分析显示出独立的簇（图1J）。LEfSe分析显示，（LDA > 2）小鼠IIR损伤后Saccharomyces减少（图1K）。随机森林分析的结果进一步证实了IIR小鼠的真菌组成发生了显著的变化，表现为Saccharomyces的显著减少和随后的网孢菌属的增加（图1L）。进一步，作者研究了真菌与肠道屏障相关生物标志物和组织细胞因子表达的相关性。在IIR损伤后，I-FABP、KC、IL18、IL6、TNF-α、GCSF和IL1 β的水平显著增加，与Saccharomyces的丰度呈负相关（图1M）。
图1 IIR模型中肠真菌的特征
2、单菌种的定殖减轻了IIR损伤
上述结果表明，在IIR过程中，酵母菌和假丝酵母（属的分类学水平）显著减少，这与IIR损伤有关。因此，作者旨在通过真菌定植实验验证这些真菌与IIR损伤的相关性。值得注意的是，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）和热带念珠菌（C. tropicalis）分别属于S. cerevisiae属（Saccharomyces）和假丝酵母属（Candida），是人和小鼠肠道的优势定殖菌。此外，S. cerevisiae和C. tropicalis在维持肠道稳态中发挥着不可替代的作用。在作者的研究中，S. cerevisiae和C. tropicalis在小鼠肠道中普遍存在，在建立IIR损伤模型之前，通过口服灌胃的方式定植于小鼠肠道（图2A）。2周后，C. tropicalis和S. cerevisiae增加且不影响其他真菌的丰度，证明定殖成功（图2B）。此外，在处死小鼠前进行异硫氰酸荧光素葡聚糖跨上皮渗透性测定。作者发现定植组血清中异硫氰酸荧光素葡聚糖浓度显著降低（图2C）。作者通过血清I-FABP检查、肠道组织H & E染色和组织学评分进一步证实，肠道屏障破坏减轻，这与功能变化一致（图2D，E）。Western blotting检测紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达（图2F）。GSDMD蛋白的N端（P30）片段是焦亡效应分子，作者证明了在IIR损伤的肠道中P30 GSDMD裂解增加（图2F）。此外，多种细胞因子呈现一致的下降趋势，尤其是与细胞焦亡相关的细胞因子（IL1β）（图2G）。以上结果证实，增加S. cerevisiae和C. tropicalis负荷可减轻IIR损伤。
为进一步证明肠道真菌可以直接影响宿主，而不是调节体内的其他菌株，采用上述处理的无菌的（GF）小鼠建立IIR模型。通过真菌平板培养和栅栏定量丰度测试鉴定了S. cerevisiae和C. tropicalis混合物处理的无菌的小鼠的粪便真菌丰度（图2H）。结果证实GF小鼠肠道内真菌缺失，且定植成功。重要的是，根据上述方法检测了IEB功能和形态，作者发现GF小鼠中的真菌定植也减轻了IIR损伤（图2I-K）。这证明S. cerevisiae和C. tropicalis通过直接作用于宿主而不受肠道中其他细菌或其他微生物的干扰，从而减轻IIR损伤。因此，作者得出，增加S. cerevisiae和C. tropicalis可以缓解IIR损伤。
图2 单菌种的定殖减轻了IIR损伤
3、预防性抗真菌治疗加重小鼠IIR损伤
探讨S. cerevisiae和C. tropicalis的减少是否会加重IIR损伤。小鼠饮用抗真菌药物氟康唑0.5 mg/mL预处理2周，随后进行IIR损伤程序（图3A）。进行真菌丰度定量分析以评估真菌清除率（图3B）和超高效液相色谱法检测体内血清氟康唑浓度（图3C）。此外，通过血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）试验来确定氟康唑的毒性作用，表明氟康唑在医学上没有毒性，不会加重损伤（图3D）。使用先前描述的方法测量肠道功能和形态，并通过真菌清除独立恶化IEB的损伤（图3E-G）。此外，肠道组织中GSDMD的裂解和细胞因子的表达均有不同程度的升高（图3H，I）。这些结果表明S. cerevisiae和C. tropicalis的清除加剧了GSDMD的裂解，促进了细胞因子的释放。
为验证真菌清除直接影响宿主，而不是氟康唑本身，作者采用上述方法对GF小鼠进行氟康唑治疗。通过检测肠道功能和形态学，作者发现氟康唑本身并没有加重IIR损伤。氟康唑处理后，血清异硫氰酸荧光素葡聚糖和I-FABP水平无明显变化（图3J，K）。这些结果证实，由于S. cerevisiae和C. tropicalis的缺失，氟康唑预处理GF小鼠并没有通过真菌清除加重IIR损伤。
图3 预防性抗真菌治疗加重小鼠IIR损伤
4、肠道真菌对GSDMD-/ -小鼠失去保护作用
作者前期发现肠道真菌主要通过抑制GSDMD裂解发挥抗脓毒症作用，由于肠道真菌清除加剧了GSDMD裂解，而在IIR损伤模型中，S. cerevisiae和C. tropicalis定植能够缓解GSDMD裂解，因此作者试图研究肠道真菌是否主要通过抑制GSDMD裂解发挥对小鼠IIR损伤的保护作用。因此，作者使用GSDMD-/ -小鼠，通过氟康唑预处理清除肠道真菌来验证作者的假设，如前所述（图4A），Western blotting证实GSDMD在GSDMD-/ -小鼠中消失（图4B）。为了验证GSDMD-/ -小鼠粪便中的真菌多样性是否与WT组一致，进行了真菌丰度的定量分析，与WT对照组相比，GSDMD-/ -小鼠的肠道中没有观察到真菌负荷的差异（图4C）。此外，为了证实GSDMD-/ -小鼠的真菌清除是否可以改变IEB的形态和功能，作者测定了血清中异硫氰酸荧光素葡聚糖和I-FABP的浓度、肠黏膜损伤评分和上皮紧密连接蛋白的表达，结果证实GSDMD-/ -小鼠的真菌负荷减少并没有恶化屏障损伤（图4D-G）。此外，肠道组织上清液中的细胞因子水平也没有差异（图4H）。此外，与WT对照组相比，GSDMD-/ -小鼠的IIR损伤显著降低。因此，作者得出结论，在GSDMD-/ -小鼠中减少S. cerevisiae和C. tropicalis的真菌负荷并不能加重IIR损伤，而这些真菌通过抑制GSDMD裂解来减轻IIR损伤。
图4 肠道真菌清除不会加剧GSDMD-/-小鼠的GSDMD裂解
5、甘露醇复制酿酒葡萄球菌喝热带葡萄球菌对IIR损伤的保护作用
鉴于S. cerevisiae和C. tropicalis对IIR损伤的缓解作用，作者研究了这些真菌是否具有共同的活性物质。值得注意的是，S. cerevisiae和C. tropicalis是两种具有相同结构成分的酵母，即甘露聚糖，它是酵母细胞壁和周质空间的主要组成部分。此外，大量研究表明甘露聚糖单独提供免疫保护。作者前期发现甘露聚糖可以抑制GSDMD的裂解。为确认甘露聚糖是否是S. cerevisiae和C. tropicalis保护IIR损伤的关键成分，C57/B6小鼠在IIR损伤模型前用甘露聚糖（0.1 mg / mL）预处理2周，通过他们的饮水（图5A）。有趣的是，通过比较肠道形态和功能，IEB结构和功能得以保留，与单真菌菌株定植的作用一致（图5B-F），以及GSDMD裂解和细胞因子表达的水平一致（图5D，F）。这一结果证实了S. cerevisiae和C. tropicalis在IIR损伤中的作用可能与甘露聚糖有关。同时，GF小鼠也用甘露醇处理，进行IIR损伤评价。结果显示GF小鼠对IIR损伤具有相同的保护作用（图5G-I）。
图5 甘露醇复制IIR损伤中肠道真菌的保护作用
6、甘露聚糖在IIR损伤中的保护作用依赖于巨噬细胞的参与
为了进一步研究甘露聚糖与宿主之间的相互作用，作者将Cyanine3（Cy3）荧光标记物共价连接到甘露聚糖上（图6A），发现小鼠口服灌胃后，甘露聚糖仅与F4 / 80标记的巨噬细胞共定位（图6B）。这一结果表明，甘露聚糖在进入肠道后被巨噬细胞识别并发生相应作用。在体外，将Cy3-甘露聚糖加入到RAW264.7细胞中，显示甘露聚糖在孵育6 h后进入RAW264.7细胞（图6B）。流式细胞术结果显示甘露聚糖可以减少肠道中巨噬细胞（F4 / 80 + CD45.2 +）的数量。为进一步证明甘露聚糖的保护作用与巨噬细胞有关，在建立IIR模型前3天腹腔注射liposomal clodronate，以清除肠道中的巨噬细胞（图6C）。结果表明，liposomal clodronate减少了肠道中巨噬细胞的数量。比较肠道形态和功能发现，巨噬细胞清除后，甘露聚糖的保护作用减弱，无统计学差异（图6D-G）。同时，IIR损伤引起的GSDMD裂解和细胞因子表达水平也有所减轻，无统计学差异（图6G-H）。这些结果表明甘露聚糖通过巨噬细胞发挥保护作用。
图6 IIR损伤中甘聚糖的保护作用依赖于巨噬细胞的参与
7、单菌株和甘露聚糖均可通过降低巨噬细胞SAA1的表达来缓解GSDMD裂解
为进一步探索S. cerevisiae和C. tropicalis通过巨噬细胞减轻IIR损伤的关键途径，作者在建立IIR损伤模型之前，对单菌株或甘露聚糖处理的小鼠肠道组织进行了RNA-Seq。作者在RNA-Seq结果中发现血清淀粉样蛋白a1（SAA1）水平显著降低，并使用qPCR独立验证mRNA表达（图7A，B）。SAA1是一种急性时相蛋白，已被证明与急性炎症密切相关，并加重多种炎症性疾病的发生和发展。为了检测SAA1蛋白在肠道中的表达分布，作者进行了免疫组织化学实验，结果显示SAA1主要在肠道内皮细胞中表达，而在预处理的小鼠中SAA1的表达明显较少（图7C）。此外，免疫荧光染色检测到F4 / 80标记的肠巨噬细胞中SAA1蛋白表达下降（图7D）。为了证实甘露聚糖在体外是否可以降低SAA1，用甘露聚糖（1mg/mL）处理RAW264.7细胞6 h，然后移至含1 µg/mL脂多糖类（LPS）的培养基中孵育2 h，用于增加SAA1的基础表达。作者发现SAA1在的mRNA和蛋白水平表达均降低（图7E，F）。这一结果与作者发现的巨噬细胞参与甘露聚糖的保护作用一致，证明甘露聚糖通过减少巨噬细胞SAA1分泌发挥保护作用。
作者先前的工作已经证明了甘露聚糖可减少IIR损伤中GSDMD介导的细胞焦亡。越来越多的证据表明，SAA1与GSDMD介导的细胞焦亡密切相关。此外，作者通过免疫组化实验发现GSDMD主要在IIR损伤时的IECs中表达（图3）。因此，作者使用SAA1蛋白（600 ng/mL）处理的小鼠肠上皮细胞（MODE-K）在氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型中，进一步证明SAA1在体外直接加剧GSDMD裂解（图7G）。此外，由于SAA1蛋白刺激（图7G，H），紧密连接蛋白也表现出明显的损伤。利用qPCR检测SAA1处理MODE-K细胞后GSDMD、NLRP3、IL1 β、IL18、Caspase-1和Caspase-11的mRNA表达（图7H）。这些结果提示GSDMD裂解的加剧可能是GSDMD和NLRP3表达上调所致。综上所述，肠道真菌通过降低巨噬细胞中SAA1的表达，从而缓解IECs中GSDMD的裂解，减轻IIR损伤损伤。
图7 单菌株和甘露聚糖均可通过降低巨噬细胞SAA1的表达来缓解GSDMD裂解
结论
本研究结果提示，IIR损伤后肠道真菌发生紊乱。S. cerevisiae和C. tropicalis具有通过甘露聚糖抑制巨噬细胞中SAA1的表达和减少IECs中GSDMD切割来减轻IIR损伤的潜力。本研究揭示了血液透析中IIR损伤的新机制，并提示维持肠道真菌稳态可能是预防IIR损伤的新疗法。
实验方法
临床样本收集，肠系膜上动脉（SMA）超声检查，ITS1 sequencing，C57BL/6J小鼠，IIR小鼠模型构建，真菌DNA提取，ELISA试剂盒检测肠道功能的特殊生物标志物，超高效液相色谱，H&E染色，血清细胞因子检测，Western blot assay，免疫组化染色分析SAA1和GSDMD的水平，免疫荧光，RNA-seq，PCR分析
参考文献
Chen Y, Han B, Guan X, Du G, Sheng B, Tang X, Zhang Q, Xie H, Jiang X, Tan Q, Chen S, Wang J, Chen W, Xiao W. Enteric fungi protect against intestinal ischemia-reperfusion injury via inhibiting the SAA1-GSDMD pathway. J Adv Res. 2023 Sep 15:S2090-1232（23）00258-8. doi: 10.1016/j.jare.2023.09.008. Epub ahead of print. PMID: 37717911.