膀胱癌中TRMT6 / 61A依赖的碱基甲基化调控基因沉默活性和未折叠蛋白反应

       RNA修饰是RNA功能的重要调控元件。然而，大多数RNA修饰的全基因组图谱都集中在信使RNA和转移RNA上，但缺乏小RNA的此类数据集。在这里，作者绘制了细胞小RNA空间中的N1 -甲基腺苷（m1 A）。以合成的m1 - A RNA为基准，作者的工作流程确定了含有m1 - A的小RNA的特定组，否则不成比例地代表性不足。特别是，22个核苷酸长的3 ' tRNA片段高度富集于位于种子区的trmt6 / 61a依赖性m1 A。TRMT6/ 61a依赖性m1 - A负性影响trf -3的基因沉默。在TRMT6/61A过表达的膀胱尿路上皮癌中，检测到tRF上较高的m1 A修饰，与tRF靶组失调相关。最后，TRMT6/61A调节参与未折叠蛋白反应的tRF-3靶点。总之，作者的研究结果揭示了通过小RNA的碱基修饰调节基因表达的机制。这篇文章于2022年4月发表于《Nature Communication》IF：16.6。
技术路线

技术路线图

主要研究结果
1. 小RNA空间中m1A位点的系统制图
       已知m1A会中断常规的沃森-克里克A:U碱基配对（图1a），并在为HTS准备文库时导致逆转录酶（RT）停滞。该特性可用于通过m1A位置的错配（错误结合）来绘制m1A位点。为了系统地绘制小RNA（<50个核苷酸长）中潜在的m1A位点，作者结合了两种独立的方法（图1b）: m1A抗体富集，然后进行小RNA测序（m1A- rip -seq）和m1A诱导的错配测序。为了首先确定用于标准小RNA测序的m1A兼容RT，使用具有单个m1A位点的合成小RNA测试了三种候选RT （protoscriptii -一种常用的M-MuLV RT，tgir -模板切换组II逆转录酶和工程HIV RT-1306）。选择TGIRT和RT-1306进行测试是基于它们之前在测序含有m1a的mRNA和tRNA方面的成功。实验流程（图1c，左下）如下:小RNA先与3′端接头连接，然后与5′端接头连接，然后引物启动RT反应生成cDNA，然后用覆盖两个接头序列的引物进行PCR扩增。作者的策略确保只有可读取的产品将被克隆并用于下游的错配分析，以进行m1A修改估计。通过在RT步骤之前包括5 '接头连接，作者消除了由于与PCR扩增的5 '引物缺乏互补性而导致任何RT延迟产物被克隆为截断产物的可能性。这种方法对于小RNA是首先考虑的，因为它们通常只有几个碱基不同，特别是对于trf。例如，18-nt tRF-3和22-nt tRF-3已被证明通过不同的机制调节LTR功能。使用这一工作流程，合成m1A位点的错配指数（由A到T/G/C突变计算）对于TGIRT和RT-1306来说，在不同的m1A化学计量中都显示出很高的灵敏度和动态范围（图1c）。然而，当m1A存在于<=60%的合成短RNA中时，通常用于短RNA测序的逆转录酶ProtoScriptII产生的错配率低于5%（图1c）。与TGIRT和RT-1306相比，克隆频率较低，当100%的RNA具有m1A时可以看出（图1d）。最后，当与m1A抗体富集（m1A- rip）结合使用时，TGIRT和ProtoScriptII都能够检测到插入细胞小RNA的合成m1A RNA的富集（图1e）。基于上述分析，作者选择了TGIRT来进一步鉴定内源性m1A小RNA。

图1小RNA空间中m1A位点的系统制图

2. 特异性tRNA衍生片段高度富集于m1A
       为了鉴定内源性含有m1A的小RNA，将m1A RIP应用于细胞中纯化的短RNA。HEK293T细胞中m1A修饰的tRNA通过m1A RIP富集并洗脱成功（图2a）。对于有一个碱基错配的tRF reads， m1A RIP的富集更为突出，可能是在m1A修饰的位点（图2b）。在microRNAs或其他小RNA中，m1A RIP未观察到这种错配相关的富集（图2b）。在m1A RIP后，大多数含有错配的tRF读取具有A到C/G/T不匹配（细胞质tRF为90%，线粒体tRF为95%）（图2b），表明修饰的（容易错配的）腺苷特异性富集，最有可能是m1A。
       根据起始和结束位置，tRNA片段可以分为三组（图2c）22，30，34:（1）映射到成熟tRNA的极端3 ' CCA端的tRF-3s，（2）映射到成熟tRNA的极端5 '端的tRF-5s，以及（3）包含前体tRNA的尾链序列（通常以poly-U结尾）的tRF-1s。成熟tRNA的3′端trf优先被m1A抗体富集，而5′端trf相对microRNA轻度富集，tRF-1s不富集（图2d， e）。此外，与18-nt tRF-3a相比，22-nt tRF-3b被m1A抗体特异性富集（图2f），这表明只有22-nt而不是18-nt tRF-3s含有m1A。值得注意的是，tRF-3b（图2f）的富集程度与峰值控制的m1A RNA（图1e）相似。输入样品的TGIRT误掺入特征也得到了m1A在特定trf -3上的位置和化学计量。在所有22 nt的tRF-3b的第四个位置（A4）观察到最高的错配率（图3b， c）。这种高错配率具有高度特异性:在tRF-3b的其他位置（图3c）或18 nt的tRF-3a上没有观察到。有趣的是，一些microRNA被m1A RIP显著富集（图2d），但未能显示位点特异性错配模式，因此作者在本报告中没有将它们报道为真正的含有m1A的小RNA（在Discussion中进一步讨论）。这些都表明tRF-3b是含有m1a的小RNA。
       由于确定的大多数m1A位点都处于高化学计量，因此作者跳过了m1A RIP，仅使用TGIRT错配特征来量化特定位点的m1A，以便进行以下分析。

图2特异性tRNA衍生片段高度富集于m1A

3. 22个核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依赖于TRMT6/61A
       22-nt tRF-3b上的A4位置与成熟tRNA上的A58位置相对应（图3a）。胞质tRNAs上的m1A58由异源二聚体酶复合物TRMT6/TRMT61A（或酵母中的GCD10/GCD14）催化。为了测试tRF-3b上的m1A是否由TRMT6/61A引入的修饰（可能在亲本tRNA上），在TRMT6/61A敲低后评估了错误合并特征（图3b-e）。当TRMT6/61A被敲除（图3d）时，除了tRNAiMet中的trf -3外，m1a依赖的trf -3错结合在全球范围内减少（图3b， c）。在HeLa和U251细胞中也观察到siTRMT6/61A或单独使用siTRMT61A的较低的tRF-3b A4错掺率（图3f）。尽管TRMT6/61A敲除后，携带ProtoScriptII的tRF-3b的克隆频率显著增加，但Northern blots未检测到tRF-3b和tRNA的稳态水平有任何变化（图3g）。这证实了携带m1a的小RNA在这种常用的ProtoScriptII RT中代表性不足。

图3 22个核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依赖于TRMT6/61A

4. m1A减弱了trf -3的基因沉默
       m1A在tRF-3上特定位置的存在提出了一种有趣的可能性，即它可能调节tRF-3的功能，特别是如果它涉及碱基配对或蛋白质结合。已经在多种生物学途径中发现了trf -3，特别是依赖于引导小RNA（trf -3）与靶RNA之间碱基配对的基因沉默途径（图4a）。这些依赖ago的基因沉默机制可能受到tRF-3s 4位m1A的影响，该位置位于与目标RNAs25，45碱基配对所必需的种子区。
       为了直接测试m1A对tRF-3b基因沉默活性的影响，作者生成了双荧光素酶报告基因，在Renilla荧光素酶基因的3 ' UTR中有tRF-3靶位，可以归一化为萤火虫荧光素酶信号（图4b）。只有未经a4修饰的tRF-3b触发了基因沉默，而m1a4修饰的tRF-3b则消除了这种基因沉默（图4c-f）。对来自不同氨基酸群的四个不同的tRF-3b序列（tRNALeu的tRF-3009b， tRNAAla的tRF-3021b， tRNATyr的tRF-3030b和tRNAGln的tRF-3004b）观察到这种效应。
       为了确保tRF的抑制不是过度表达的产物，作者还通过LNA（锁定的核酸）敲低了内源性tRF-3。抗tRF-3021特异性地抑制了tRF-3021报告因子的活性（图4）。同样，tRF-3009、tRF-3030和tRF-3004报告基因活性被相应的LNAs去抑制（图4h-j）。
       总的来说，这表明由于种子退火到靶mRNA的问题，m1A减弱了tRF-3b的基因沉默。

图4 m1A减弱了trf -3的基因沉默

5. TRMT6 / 61A依赖性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相关性
       由于tRF-3b上的m1A阻止了tRF-3b的沉默（图4），作者测试了这种修饰是否降低了内源性trf -3与Ago2的关联。为此，作者创建了一个稳定表达flag - ha标记的Ago2的细胞系（图5a）。tgrt -seq在前100个与ago2相关的小RNA中鉴定出了trf -3（图5b）。敲除TRMT6/61A后（图5c），与m1A修饰相对应的读段错配百分比在与ago2相关的片段中（a）减少，但在与ago2相关的片段中（b）相对于输入片段而言，没有增加或减少（图5d）。因此，TRMT6/61A对两个片段中trf -3上的m1A的调节是相同的。m1A修饰不排除tRF-3b进入与Argonaute的复合物。在敲除TRMT6/61A后，ago2相关部分中有几种trf -3的少量（1-3倍）增加，但没有超过FDR <0.05的阈值（图5e）。相对于输入部分，Ago相关部分中tRF-3水平没有任何变化，这表明trmt6 /61依赖的m1A对tRF-3种子区域的修饰不会显著影响Ago的直接结合。有趣的是，尽管在输入和Ago结合的部分中，TRMT6/61A调节了总tRF-3b错配（m1A修饰）的百分比（图5d）。综合来看，m1A修饰的tRF-3s不会降低它们的Ago关联，因此基因沉默的衰减很可能是因为与目标mRNA的碱基配对减少（图4）。

图5 TRMT6 / 61A依赖性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相关性

6. tRF-3b介导的m1a依赖性基因沉默变化
       引导RNA 2-4位的碱基配对对于ago介导的基因沉默至关重要45。tRF-3b上的m1A特异性位于第4位（图2和图3）。由于m1A阻断了典型的A:U碱基配对，作者假设，m1A在tRF-3种子区与靶RNA的碱基配对减弱，解释了含有m1A的tRF-3中观察到的基因沉默活性降低（图4）。为了验证这一假设，作者首先通过图6a总结的策略确定了可能受m1A状态调节的潜在tRF-3靶RNA。作者确定了顶部ago2相关的tRF-3b中的哪些种子（图6b）也是TRMT6/61A敲除后m1A修饰减少最多的种子，以确定最有可能遭受生物学上显著的靶标预测干扰的种子（图6c）。作者根据3 ' UTR中的互补性预测这些种子的靶标。RNA-seq显示，当TRMT6/61A被敲除，tRF-3b在第4位被m1A低修饰时，这些种子的靶标比非靶标明显受到抑制（图6d）。
       预测具有8-mer和7-mer匹配的靶标比种子中与6-mer匹配的靶标受到更显著的抑制（图6d， e）。在siTRMT6/61A之后，分别通过qPCR验证了最显著抑制的8/7-mer tRF-3靶标（TIMP3， CREB3L2， MBTPS1， CDK19， HIPK2， HERPUD1， RMND5A， ELMOD2和HLTF）的抑制（图6f）。
       为了证实这种基因抑制是由靶向3 ' UTR的tRF-3介导的，作者将具有单个进化保守的tRF-3靶向8-mer位点的内源性MBTPS1 3 ' UTR序列克隆到双荧光素酶报告基因中。MBTPS1 3 ' UTR报告基因确实被siTRMT6/61A抑制（图6g）。另一个8-mer靶基因CREB3L2也得到了类似的结果（图6g）。这两个8-mer位点均由种子序列“TCAAATCT”预测，由tRNAGln中的tRF-3b代表（图6b）。与预测一致，通过从tRNAGln中过表达未经修饰的tRF-3004b可以模拟sitrmt依赖性抑制，而TRMT6/61A的表达不会减少（图6h），而m1a修饰的tRF-3004b对3 ' UTR报告基因的抑制能力明显较弱（图6i）。综上所述，tRF-3可以通过种子与目标3 ' UTRs配对来调节基因的全局表达，而这一过程受到tRF-3种子区m1A修饰的干扰。

图6 tRF-3b介导的m1a依赖性基因沉默变化

7. 膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶点的改变
       据报道，一些tRNA修饰酶，包括TRMT6/61A，在几种癌症类型中显著上调47。TRMT6上调在膀胱尿路上皮癌（BLCA）中是显著的（图7a）。最重要的是，通过western blotting检测到肿瘤样品中TRMT6和TRMT61A蛋白水平的显著上调（图7b， c）。
       TRMT6表达水平与tRF-3b整体m1A错配水平呈正相关，并且在BLCA肿瘤样本中m1A错配显著增加，这与TRMT6/ 61a较高的表达水平一致（图7d， e）。与较高水平的干扰m1A修饰相一致，在作者的实验数据中，与正常相比，通过种子-mer匹配预测的tRF-3b靶RNA在BLCA肿瘤样本中比非靶点上调（图7f）。组合种子和补充图7e:单个种子）。此外，在TCGA BLCA数据中，TRMT6水平高的肿瘤诱导了tRF-3b靶点（图7g）。有趣的是，在被siTRMT6/61A抑制的9个trmt3靶点中，有8个（图6e）在TCGA膀胱患者样本中与TRMT6的表达呈显著正相关（图7h）。综上所述，这些结果表明TRMT6/61A调节肿瘤中tRF-3上的m1A水平，并且BLCA中TRMT6/61A的升高与肿瘤中tRF-3靶点的预期诱导有关。

图7膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶点的改变

8. TRMT6/61A修饰tRF-3b对于维持未折叠蛋白的反应至关重要
       为了探索m1a依赖性tRF-3靶点的潜在生物学功能，作者通过RNA-seq数据的基因集富集分析，重点研究了siTRMT6/61A显著下调和高trmt6肿瘤样本中显著上调的生物学途径。针对1532个Reactome通路的富集分析在细胞系和患者数据中发现了7个重叠通路。其中一种途径是未折叠蛋白反应或UPR（图8a， b）。
       m1a依赖的tRF-3靶点，特别是MBTPS1（也称为1位点蛋白酶或S1P）和CREB3L2，先前与UPR和蛋白质分泌有关48，49，这表明TRMT6/61A可能通过去抑制这些tRF-3靶点来帮助维持生长细胞中的UPR。MBTPS1 （S1P）因其切割和激活高尔基体上不同蛋白质底物的作用而闻名，包括转录因子ATF6和creb3l250，51，52。为了直接测试TRMT6/61A是否在内质网应激下调节UPR，作者使用了一个由最小启动子驱动的荧光素酶报告子，该启动子带有内质网应激反应元件2 （ERSE2），可被ATF6转录因子53激活。报告显示，正如预期的那样，荧光素酶活性增加依赖于内质网反应元件和内质网应激（tunicamycin， Tm）。在HEK293T和T24膀胱癌细胞系中，TRMT6/61A敲低可显著抑制UPR诱导的应激反应（图8c）。转染未修饰的tRF-3004b，而不转染m1A修饰的tRF-3004b，相对于NT1和NT2非靶向RNA，可以降低UPR报告基因的活性（图8d），这表明tRF-3b上的m1A状态可以直接调节未折叠蛋白的反应。为了确保内源性tRF-3004b抑制参与UPR的靶基因，作者通过LNA敲低了内源性tRF-3004b，这在ER应激后显著增加了靶细胞基因CREB3L2、HERPUD1、MBTPS1和HLTF的水平（图8e、f）。总之，这表明trmt6 / 61a介导的trf -3上的m1A修饰对维持UPR稳态很重要。

图8 TRMT6/61A修饰tRF-3b对于维持未折叠蛋白的反应至关重要

结论
       最后，快速增殖的癌细胞通过激活促存活UPR来维持蛋白稳态以减轻内质网应激。因此，UPR与癌症特征的许多方面密切相关，并已成为有希望的治疗靶点。先前已经注意到，在包括膀胱癌在内的几种癌症类型中，uprr相关基因在全球范围内上调68。在这里，作者发现TRMT6/61A最可能通过修饰tRF-3来促进UPR，并去抑制tRF-3在UPR通路的ATF6分支中的靶点MBTPS1和CREB3L2。有趣的是，MBTPS1和CREB3L2可以被tRNAGln中的tRF-3004b靶向，tRNAGln是一种被发现在酵母中调节UPR的tRNA 69。当然，作者不排除TRMT6/61A通过修饰tRNA和mRNA对UPR产生额外影响的可能性。作者如何利用本文描述的机制使肿瘤细胞对促凋亡UPR敏感将是未来另一个有趣的研究课题。

实验方法
细胞培养，RNA净化，合成m1A RNA寡核苷酸，RIP免疫沉淀反应，小RNA-seq文库制备，小RNA-seq图谱和错配分析，敲低TRMT6/61 A，Northern blot，双荧光素酶报告试验，锁定核酸（LNA）敲除内源性tRF，RT-qPCR，RNA-seq文库的制备和分析，蛋白提取和Western Blot，未折叠蛋白反应报告试验。
参考文献：
Su Z, Monshaugen I, Wilson B, Wang F, Klungland A, Ougland R, Dutta A. TRMT6/61A-dependent base methylation of tRNA-derived fragments regulates gene-silencing activity and the unfolded protein response in bladder cancer. Nat Commun. 2022 Apr 20;13(1):2165. doi: 10.1038/s41467-022-29790-8. PMID: 35444240; PMCID: PMC9021294.

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