乳酸化修饰介导饮食限制的长寿秘诀

       众所周知，饮食限制（DR）能促进自噬，从而发挥其长寿效应。虽然SAMS-1（S-腺苷蛋氨酸合成酶-1）已被证明是DR反应的关键介质，但人们对S-腺苷蛋氨酸（SAM）和 SAM 依赖性甲基转移酶在自噬和 DR 诱导的长寿中的作用知之甚少。在这项研究中，我们发现 DR 和 SAMS-1 通过限制 SAM 的供应，抑制了组蛋白 H3K4 甲基转移酶 SET-2 的活性。因此，降低的 H3K4me3 水平促进了两种转录因子 HLH-30/TFEB 和 PHA-4/FOXA 的表达和活性，这两种转录因子都能调节自噬相关基因的转录。然后我们发现，HLH-30/TFEB 和 PHA-4/FOXA 在它们共同的靶基因上协同作用，介导了自噬相关基因的转录反应，从而延长了动物的寿命。因此，我们的研究表明，SAMS-1-SET-2轴是一个营养传感模块，可从表观遗传学角度协调HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA转录因子的激活，从而控制大自噬/自噬和对DR的长寿反应。
       本文于2023年1月发表在《Autophagy》IF: 13.3期刊上。
技术路线

实验结果
1、自噬激活是sams-1突变体长寿的必要条件
       为了解sams-1是否控制自噬以调节衰老速度，首先使用表达GFP标记的LGG-1，Atg8/LC3的同源物，来监测自噬。作者发现，在sams-1(ok2946)突变体的不同组织中，GFP::LGG-1自噬小体的数量都有所增加，包括下胚层接缝细胞、肌肉细胞、咽球和肠细胞（图1A）。还发现与对照组相比，sams-1 RNAi显著增加了自噬通量（图1B）。接下来探究自噬相关基因是否是sams-1突变体长寿的必要条件。结果发现，一些自噬相关基因，如bec-1、vps-34或lgg-1/lgg-2/Atg8的敲除抑制了sams-1(ok2946)突变体的寿命（图1c）。总之，这些结果表明，sams-1失活可刺激自噬，从而促进长寿。

图1自噬激活是sams-1突变体长寿的必要条件

2、HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA介导sams-1突变体的自噬和寿命
       通过文献发现HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA与自噬相关。本文发现当sams-1基因敲除时，HLH-30和PHA-4的蛋白和mRNA表达均上调（图2a-c），表明sams-1 可能调控hlh-30和pha-4的转录。此外，通过测量HLH-30的核与细胞质比率，发现在sams-1基因敲除突变体中，HLH-30的核易位增强（图2d）。与此相一致的是，在sams-1（ok2946）突变体中，一些自噬相关基因，包括lgg-1、lgg-2、sqst-1/p62、atg-4.1、atg-11、epg-3、epg-5、allo-1和vps-34的表达水平都有所增加（图2c）。
       此外，作者发现，SAM补充显著废除了HLH-30的核易位（图2D）。为研究在sams-1突变体中观察到的自噬活性和寿命的增加是否需要HLH-30或PHA-4的活性，首先评估hlh-30或pha-4 RNAi对自噬活性的影响。发现hlh-30或pha-4的敲除显著抑制sams-1（ok2946）突变体自噬通量的增加，其次也抑制了eat-2（-）DR动物自噬通量的增加（图2e、f）。敲除hlh-30或pha-4完全抑制了sams-1（ok2946）突变体寿命的延长（图2g，h），表明HLH-30或PHA-4的活性对sams-1（ok2946）突变体寿命的延长至关重要。综上所述，sams-1可能调节HLH-30和PHA-4的表达和活性，从而介导自噬和寿命。

图2 HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA介导sams-1突变体的自噬和寿命

3、SET-2是一种H3K4甲基转移酶，通过HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA调节自噬
       由于补充SAM可完全消除sams-1突变体中的HLH-30核易位表型，作者推测SAMS-1的下游有一个或多个甲基转移酶在调节HLH-30的活性。因此，以HLH-30核易位为读数，进行了小规模的蛋白质甲基转移酶RNAi筛选。set-2的无效突变也显著增加了HLH-30的核易位（图3a）。值得注意的是，在sams-1（ok2946）无效突变体中，HLH-30核质比高于set-2（bn129）无效突变体（图3a），这表明在sams-1突变体中HLH-30核易位的诱导作用强于set-2突变体。因此，其他基因也可能在sams-1的下游发挥作用，与set-2平行调节HLH-30的核易位。
       与sams-1基因缺失类似，set-2 基因缺失也增加HLH-30和PHA-4的mRNA和蛋白表达（图3b-d）。此外，发现在set-2（ok952）突变体的下胚层缝细胞、肌肉细胞、咽球和肠细胞中，GFP::LGG-1点的数量增加，这表明set-2（ok952）突变体的自噬活性增强（图3e）。在表达gfp::lgg-1::mcherry::lgg-1ΔG的set-2（bn129）突变体中，GFP:mCherry信号比降低，这也表明自噬通量增加（图3f）。此外，作者发现自噬通量的增加需要HLH-30和PHA-4的活性（图3g）。总之，这些结果表明SET-2通过HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA调节自噬。

图3 SET-2是一种H3K4甲基转移酶，通过HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA调节自噬

4、SET-2在DR通路中起作用，需要自噬相关基因来促进寿命
       为进一步了解SET-2在DR诱导的长寿中的作用，作者进行了各种遗传显性分析，以探究set-2与sams-1和DR在寿命调控中的遗传关系。首先创建了set-2过表达株系，提高了全局H3K4me3水平，改善了set-2（bn129）突变体的长寿表型，结果发现，set-2过表达能改善sams-1突变体的寿命表型（图4a），这表明set-2在寿命调控中作用于sams-1的下游。过表达set-2会缩短eat-2(ad1116)突变体的寿命（图4b）。总之set-2在调控DR诱导的长寿过程中作用于sams-1 的下游。
       接着询问自噬相关转录因子和基因是否也是延长set-2突变体寿命所必需的，正如在sams-1突变体（图1c，图2g，h）和eat-2突变体中所观察到的那样。敲除转录因子hlh-30或pha-4（图4c、d）或自噬相关基因bec-1、vps-34或lgg-1/lgg-2完全抑制了set-2（ok952）突变体寿命的延长（图4e、f）。综上所述，SET-2甲基转移酶活性降低会激活HLH-30和PHA-4，从而介导DR诱导的长寿。

图4 SET-2在DR通路中起作用，需要自噬相关基因来促进寿命

5、AMX-1 H3K4去甲基化酶在调控HLH-30/TFEB中拮抗SET-2
       接下来研究amx-1耗竭对SAMS-1/SET-2介导的HLH-30活化的影响。结果发现，amx-1 RNAi抑制了sams-1 RNAi诱导的HLH-30核易位（图5a）。amx-1 RNAi还抑制了eat-2(ad1116)和set-2(bn129)动物的HLH-30核易位（图5b）。amx-1的RNAi敲除也降低了eat-2和set-2突变体中hlh-30的mRNA和蛋白表达（图5c）。此外，amx-1 RNAi抑制了sams-1 RNAi诱导的自噬通量激活，这表明amx-1调控自噬激活（图5d）。通过遗传显性分析，发现敲除amx-1能显著缩短sams-1（ok2946）、set-2（ok952）和eat-2（ad1116）突变体的寿命（图5e-g）。综上所述，amx-1能拮抗set-2对自噬和寿命的调控作用。

图5 AMX-1 H3K4去甲基化酶在调控HLH-30/TFEB中拮抗SET-2

6、SET-2和AMX-1调节H3K4me3水平，控制HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA的表达
       由于SET-2和AMX-1控制组蛋白H3K4三甲基化的动态变化，因此假设HLH-30和PHA-4的表达受hlh-30和pha-4启动子区H3K4三甲基化状态的转录调控。结果发现，在sams-1(ok2946)和eat-2(ad1116)突变体中，全局H3K4me3水平明显下降（图6a）。
       然后，通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验研究set-2和sams-1突变体中hlh-30启动子的H3K4me3水平。发现，在set-2（bn129）和sams-1（ok2946）突变体中，hlh-30启动子的H3K4me3水平显著降低（图6b）。HLH-30与自身启动子结合的增加表明启动子活性增加。在sams-1（ok2946）和set-2（bn129）突变体中，HLH-30在其启动子上的招募都有所增加（图6c）。因此，在sams-1和set-2突变体中，低H3K4me3水平和HLH-30与hlh-30启动子结合的增加可能与这些动物中hlh-30转录的诱导相对应。
       DR增加pha-4的表达，但这种诱导的基本机制完全未知。作者假设，与hlh-30相似，pha-4的表达也受H3K4me3水平变化的控制。在这里，作者发现与WT N2相比，sams-1（ok2946）和set-2（bn129）突变体中pha-4启动子的H3K4me3 水平也有所下降（图6d），这表明饥饿过程中hlh-30和pha-4的诱导都是组蛋白标记变化的结果。同样，在amx-1突变体中，hlh-30和pha-4启动子的H3K4me3水平也有所增加（图6e，f）。综上所述，DR可能通过SAMS-1和SET-2调节H3K4me3的动态，从而控制hlh-30和pha-4的表达，进而控制自噬和寿命。

图6 SET-2和AMX-1调节H3K4me3水平，控制HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA的表达

7、HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA协同调节自噬和寿命
       作者猜测HLH-30和PHA-4也可能共同占据自噬相关基因的启动子，并对其转录进行核心调节。为验证这一假设，分析了modENCODE项目（ftp://data.modencode.org/）中的HLH-30和PHA-4 ChIP测序数据集。对结合位点分布的分析表明，HLH-30和PHA-4结合位点富集在转录起始位点（TSS）上游约50 bp的范围内（图7a）。51%的HLH-30结合位点与PHA-4结合位点重叠，而38%的PHA-4结合位点与HLH-30结合位点重叠（图7b）。有886个基因的启动子区域同时包含HLH-30和PHA-4结合位点（图7b）。值得注意的是，这些数据集来自喂养的蠕虫，表明在非刺激条件下，这两种转录因子与共同靶基因的结合存在基础水平。
       然后，比较HLH-30和PHA-4的峰值中心之间的距离。距离分布显示，它们的峰值中心之间的距离大多为~100 bp，表明这两个转录因子在基因组上的存在位置很近（图7c）。这些数据表明，这两个转录因子可能共同占据了相同的启动子区域，或者至少结合到了附近的位点，从而合作调控它们共同靶标的转录。
       然后，进行GO富集分析，以确定这886个共同靶基因的功能注释。发现"自噬"和"衰老"在其中占了很大比例（图7d）。与ChIP-seq分析一致，在非刺激条件下，HLH-30和PHA-4都与lgg-1启动子结合（图7e，f）。在sams-1（ok2946）和set-2（bn129）突变体中，这两种转录因子在lgg-1启动子上的结合都有所增加，这可能导致了lgg-1的转录诱导。
       有趣的是，作者发现HLH-30在lgg-1和sodh-1启动子区域的结合不受RNAi 敲除pha-4的影响，而PHA-4在lgg-1和sodh-1启动子区域的结合也不受RNAi 敲除hlh-30的影响（图7g，h）。因此，综合来看，HLH-30和PHA-4可能独立地结合到它们共同靶标启动子区域的相邻位点，而不是共同占据相同的位点，从而协同控制它们的转录。

图7 HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA协同调节自噬和寿命

       总而言之，本文揭示，通过SAMS-1/SET-2轴、H3K4甲基化和HLH-30/PHA-4模块协同调节自噬相关基因的表达，提出饮食限制介导的长寿模型。在自由饮食条件下，SAMS-1合成SAM，SAM是SET-2进行组蛋白H3K4甲基化的底物。hlh-30和pha-4的基础转录水平提供了基础的自噬相关基因的转录。在DR条件下，sams-1水平降低，因此SET-2催化的H3K4甲基化所需的SAM减少。AMX-1的活性超过了SET-2的活性。因此，H3K4me3在hlh-30和pha-4启动子上的低甲基化增强了它们的转录，这反过来又导致自噬相关基因的转录增加，从而激活自噬并延长寿命。

图8通过SAM依赖性甲基化实现自噬和长寿的模型。

实验方法
C. elegans strains的培养，转基因细胞系的构建，寿命分析实验，核定位实验，GFP::LGG-1荧光标记自噬，WB，RT-qPCR，ChIP
参考文献
Lim CY, Lin HT, Kumsta C, Lu TC, Wang FY, Kang YH, Hansen M, Ching TT, Hsu AL. SAMS-1 coordinates HLH-30/TFEB and PHA-4/FOXA activities through histone methylation to mediate dietary restriction-induced autophagy and longevity. Autophagy. 2023 Jan;19(1):224-240. doi: 10.1080/15548627.2022.2068267. Epub 2022 May 3. PMID: 35503435; PMCID: PMC9809948.