西诺明通过乳酸杆菌的色氨酸代谢物改善关节炎

       肠道微生物群失调与类风湿性关节炎（RA）的发病有关。西诺明（SIN）是一种用于治疗类风湿性关节炎的有效免疫抑制和抗炎药物，但 SIN 如何调节肠道微生物群以缓解类风湿性关节炎仍未得到充分探索。为确定与SIN的RA保护作用相关的关键肠道微生物物种和微生物代谢产物，研究人员通过16S rRNA基因测序、抗生素治疗和粪便微生物群移植评估了SIN的微生物群依赖性抗RA作用。通过代谢组学分析、转录分析和靶向细菌/代谢物灌胃，探讨了SIN如何调节肠道微生物群以减轻RA的严重程度。结果发现SIN 主要通过调节Lactobacillus乳酸杆菌的丰度来恢复肠道微生物平衡，并以肠道微生物群依赖的方式显著缓解胶原诱导的关节炎（CIA）症状。SIN 能明显提高微生物色氨酸代谢物吲哚-3-丙烯酸（IA）、IPA和吲哚-3-乙酸（IAA）的含量。补充色氨酸代谢物可激活芳基烃受体（AhR）并调节 CIA 大鼠 Th17/Treg 的平衡。耐人寻味的是，SIN 能缓解关节炎症状，这与两种有益的抗 CIA 乳酸杆菌（L. paracasei副干酪乳酸杆菌和L. casei干酪乳酸杆菌）的单菌落富集有关。SIN 的治疗功能很有希望，这主要归功于通过明确靶向乳酸杆菌和微生物色氨酸代谢物激活了 AhR。肠道细菌 L. paracasei 和 L. casei 可用于减轻 CIA 的严重程度。

       本文于2023年7月发表在《Science Bulletin (Beijing)》IF：18.9期刊上。

技术路线

主要实验结果

1、SIN减轻CIA大鼠关节炎的严重程度

       为评估SIN对RA的影响，CIA大鼠分别给予对照、SIN或甲氨蝶呤，然后检查关节炎相关特征。与CIA大鼠相比，给予SIN的大鼠体重减轻（图1a），脚掌肿胀减轻（图1b），关节炎评分降低（图1c）。H&E染色显示，与CIA大鼠相比，SIN处理减少了细胞浸润和滑膜增生，软骨侵蚀和滑膜形成减少，关节腔更宽（图1d-f）。值得注意的是，与CIA组相比，SIN给药显著降低了血清RF和CCP-Ab水平（图1g, h）。进一步评估了SIN对免疫器官脾脏和胸腺指数和炎症因子的影响（图1i-n）。SIN能明显降低脾脏和胸腺指数，降低IL-6、TNF-α和IFNG水平，增加IL-4。还观察到，随着剂量从 30 mg/kg增加到 240 mg/kg，SIN 能有效减轻 CIA 的严重程度。SIN 对 CIA 的保护作用与阳性对照甲氨蝶呤相当。这些结果证明，SIN 能有效改善大鼠模型中的 CIA。

图1 SIN可减轻CIA大鼠关节炎的严重程度

2、SIN可逆转CIA大鼠肠道生态失调

       鉴于肠道微生物群对 RA 的发病有一定的影响，接下来通过对实验终点粪便样本进行 16S rRNA 基因测序，研究了 SIN 对肠道微生物群组成的影响。与 CIA 组相比，SIN 明显降低了 Chao 指数（图 2a）和 Shannon 指数（图 2b），这表明 SIN 可降低 CIA 大鼠升高的 alpha 多样性，而 alpha 多样性可通过物种丰富度和物种均匀度反映群落多样性。基于 UniFrac 的主坐标分析（PCoA）显示了各组微生物群组成的不同聚类（图 2c）。接下来比较 CIA 模型和 SIN 处理所改变的特定菌属。通过 Kruskal-Wallis H 检验选出了对照组、CIA 模型组和 SIN 组中差异显著的 57 个细菌属，并进一步利用丰度前 50 的细菌属确定了 SIN 改变的特定细菌系统型（图 2d）。热图分析表明，经过 SIN 处理后，肠道微生物群的组成发生了重大改变。与对照组大鼠相比，经 Mann-Whitney U 检验，CIA 大鼠的 29 个菌属（28 个增加，1 个减少）发生了显著变化，而补充 SIN 后，47 个菌属（11 个增加，36 个减少）发生了变化，并表现出向更健康的方向转变。

       与 CIA 组相比，相对丰度较高的细菌属（乳酸杆菌 > Romboutsia > Norank_f_ Muribaculaceae > Allobaculum > Clostridium_sensu_stricto_1）都受到 SIN 施用的显著调节（图 2e）。值得注意的是，冗余分析（RDA）表明乳酸杆菌与CIA相关指标（爪体积、TNF-α、RF和CCP-Ab）的严重程度呈负相关，这表明乳酸杆菌的富集可能参与了SIN对CIA的保护作用（图2f）。SIN治疗后肠道屏障的改善表现在Zonula occluden-1（ZO-1）、occludin、claudin-1和claudin-2的mRNA表达增加（图2g），这表明SIN可以改善肠道屏障功能障碍并减轻结肠损伤（图2h）。

图2 SIN改善CIA大鼠肠道菌群失调

3、SIN以肠道微生物依赖的方式减轻CIA

       为验证 SIN 对 CIA 大鼠的保护作用是由肠道微生物群介导的，将 SIN 处理过的 CIA 大鼠的微生物群通过每天灌胃的方式移植给 CIA 受体大鼠（图 3a）。与接受 CIA 供体大鼠肠道微生物群的 CIA 受体大鼠相比，接受 SIN 处理过的 CIA 供体大鼠肠道微生物群的 CIA 受体大鼠的 CIA 相关症状明显减轻（图 3b-d），如爪子肿胀减轻、关节炎评分降低。这些变化伴随着踝关节和滑膜组织病变的改善（图 3e-g）、血清学标记物的减少（图 3h，i）、免疫器官指数的降低（图 3j，k）和炎症细胞因子水平的下降（图 3l，m），表明 SIN 处理的 CIA 供体大鼠粪便微生物群对 CIA 具有与 SIN 处理组相似的改善作用。简而言之，SIN治疗产生的改善效果是通过肠道微生物群转移的。

图3 SIN对CIA大鼠的有益作用是通过FMT转移

4、SIN显著增加CIA大鼠的色氨酸代谢物

       越来越多的证据表明，代谢组与 RA 的分子发病机制有关。为研究 SIN 对 CIA 大鼠的保护作用是否与代谢组变化有关，对血清和粪便样本进行了非靶向代谢组分析。主成分分析表明，三组大鼠的粪便和血清代谢组明显不同（图 4a）。粪便和血清代谢组中分别有67和169个代谢物的VIP值大于1和P < 0.05。在粪便代谢组中，与对照组相比，CIA 大鼠 67 个代谢物中有 36 个（53.7%）的丰度有显著差异（图 4b；14 个上调，22 个下调），而 SIN 处理则显著逆转了 67 个代谢物中的 21 个（31.3%）（图 4c；15 个上调，6 个下调）。值得注意的是，服用 SIN 可部分逆转 CIA 诱导的代谢物变化（15 个上调，29 个下调），使大鼠粪便和血清代谢组与对照组相似（图 4d）。其中，10 个代谢物在结构上被鉴定为色氨酸代谢物，如 IA、IPA 和 IAA。这些结果表明，SIN 能显著调节 CIA 大鼠肠道色氨酸代谢物。

       作者还通过Spearman’s相关性分析研究了关节炎主要参数（爪肿、TNF-α、RF 和 CCP-Ab）与不同代谢物变化之间的相关性。色氨酸代谢物IPA、色氨酸、IA、吲哚-3-甲醛和IAA在SIN治疗组大鼠中上调，并与CIA特征呈负相关；而吲哚-4-甲醛、5-羟基吲哚乙酸、5-羟基吲哚、3-吲哚硫酸和5-羟基色氨酸在SIN治疗组大鼠中显著下降，并与CIA特征呈正相关（图4d）。由于包括 IA、IAA、IPA、IAM 和 KYN 在内的代谢物是肠道微生物色氨酸代谢的产物（图 4e），接下来作者进行了靶向代谢组学研究，通过 UHPLC-QQQ/MS 测定粪便样本中色氨酸和 5 种色氨酸代谢物（IA、IAA、IPA、IAM 和 KYN）的丰度。与对照组相比，CIA 大鼠粪便中的色氨酸、IA、IAA 和 TRY 含量明显降低，而服用 SIN 后，对照组大鼠粪便中的色氨酸、IA、IAA 和 TRY 含量明显升高（图 4f-k）。这些结果表明，SIN 能显著丰富 CIA 大鼠肠道微生物群衍生的色氨酸代谢物。

图4 SIN显著增加CIA大鼠的色氨酸代谢物

5、微生物色氨酸代谢物对大鼠具有抗CIA作用

       为研究 SIN 诱导的色氨酸代谢物富集是否取决于肠道微生物群，作者使用抗生素抑制了肠道微生物群，并通过 FMT 水平转移了 SIN 处理过的 CIA 大鼠的粪便，然后测定了色氨酸代谢物的水平。不仅上述 SIN 的保护作用减弱，还发现抗生素治疗消除了血清和粪便样本中的色氨酸代谢物，如 IA、IAA 和 IPA（图4f-k）。

       作者还发现，色氨酸代谢物 IA、IAA 和 IPA 与 CIA 相关指标呈较高的正相关性（图 5a）。这些结果促使作者研究色氨酸代谢物是否能在大鼠模型中产生抗 CIA 作用。与 CIA 大鼠相比，Try-M 能显著减轻类风湿性关节炎的严重程度，如体重减轻、爪肿减轻和关节炎评分降低（图 5b-d），同时细胞浸润和增生滑膜减少（图 5e-g），血清 RF 和 CCP-Ab 降低，脾脏和胸腺指数降低（图 5h-k）。色氨酸代谢物大大提高了 IL-10 的水平，降低了 IL-6、TNF-α 和 IL-17 的水平，从而缓解了炎症（图 5l-o）。此外，色氨酸代谢物还能改善肠道屏障功能，减轻结肠损伤（图 5p，q）。

图5 微生物色氨酸代谢物对大鼠具有抗CIA作用

6、SIN激活AhR通路减弱大鼠CIA

       为探讨SIN对CIA保护作用的机制，通过RNA-Seq分析了滑膜基因的表达谱。共获得3171个DEGs，Spearman相关性表明，基因IL-17、RORγt、NFKBIA和MAPK14与CIA相关指标的严重程度呈正相关，而Foxp3、CYP1A1和AhR与CIA特征呈负相关（图6a）。与 RNA-seq 分析一致，qPCR 检测表明 SIN 显著降低了滑膜IL-17 和 RORγt 的 mRNA 水平，提高了 AhR、CYP1A1、Foxp3 和 IL-10 的 mRNA 水平（图 6b）。流式细胞术进一步研究了滑液中 Th17 和 Treg 细胞之间的失衡。结果表明，与模型组相比，Try-M 和 SIN 能显著降低滑膜 Th17 细胞的比例（图 6c）。同样，Try-M 和 SIN 也能大大提高滑膜 Treg 细胞的比例（图 6d）。SIN和Try-M都是AhR的配体，可通过激活AhR逆转CIA大鼠体内Th17/Treg细胞的失衡。

       在CIA的发病过程中，AhR的激活会通过调节NF-κB和MAPK磷酸化影响炎症和免疫反应。为了证实 SIN 对 Th17/Treg 平衡的调节是否是由 AhR 激活通过调节 NF-κB 和 MAPK 通路触发的，作者进一步测定了滑膜中 AhR 信号、NF-κB 和 MAPK 磷酸化蛋白的表达。Western印迹分析表明，SIN或Try-M能显著降低p-p38和p-p65的蛋白水平，而SIN或Try-M能显著增强滑膜中AhR和CYP1A1的表达（图6e），表明SIN和Try-M能通过激活AhR来调节NF-κB和MAPK的磷酸化，从而减轻CIA。

图6 SIN激活AhR通路减弱大鼠CIA

7、SIN激活AhR通路以减弱MH7A细胞中的RA

       SPR 分析表明，IAA 与 AhR 具有良好的结合亲和力，估计的平衡解离常数为 2.15 × 10-8 mol/L（图 7a）。使用 AutoDock 验证了 AhR 与这三种色氨酸代谢物之间潜在的相互作用。结果表明，IAA、IA和IPA可以通过氢键、疏水作用和π-堆积与AhR结合。从亲和力值来看，这三种色氨酸代谢物明显能与 AhR 结合。同时，通过 AutoDock，SIN 也能有效地作用于 AhR（图 7b）。

       为研究SIN和Try-M激活AhR的潜在作用，使用AhR siRNA转染建立了TNF-α诱导的MH7A特异性AhR敲除细胞模型。结果表明，在 AhR 缺失的 MH7A 细胞中，SIN 和 Try-M 对 TNF-α 诱导的 Th17/Treg 失衡和炎症反应的逆转作用减弱（图 7c）。此外，在 AhR 缺乏的 MH7A 细胞中，SIN 和 Try-M 对 p-p38、p-p65、AhR 和 CYP1A1 蛋白表达的影响也减弱了（图 7d,e）。这些结果表明，在 TNF-α 诱导的 RA MH7A 细胞模型中，AhR 敲除或抑制减弱了 SIN 和 Try-M 的调节作用，这表明 SIN 和 Try-M 是以一种依赖 AhR 的方式调节 NF-κB 和 MAPK 磷酸化的。

图7 SIN激活AhR通路以减弱MH7A细胞中的RA

8、SIN介导的副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌的富集通过调节色氨酸代谢来减弱CIA

       联合分析显示乳酸菌与粪便样品中包括IA、IAA、IPA、KYN在内的Try-M水平呈正相关（图8a）。接下来探讨了副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌与 CIA 之间可能存在的因果关系。作者每天给CIA大鼠灌胃副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌，持续4周，然后检查CIA相关指标（图8b）。与CIA大鼠相比，口服副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌能显著减轻爪肿胀和关节炎评分，降低RF和CCP-Ab水平，以及炎性细胞因子、免疫器官指数、踝关节和滑膜组织病变（图8c-l）。值得注意的是，与模型组相比，副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌治疗可调节滑膜的 AhR 和 Th17/Treg 相关基因，包括 AhR、CYP1A1、Foxp3、IL-10、IL-17 和 RORγt（图 8m）。重要的是，灌胃副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌的 CIA 大鼠体内色氨酸和粪便中来自微生物色氨酸代谢的吲哚衍生物（IA、IAA、IPA）的浓度明显更高（图 8n-s）。这些研究结果表明，SIN 可以显著富集两种有益的乳酸杆菌--副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌，它们能够通过调节色氨酸代谢和激活 AhR 来降低 CIA 大鼠的 RA。 

图8 SIN富集L. paracasei（副干酪乳杆菌）和L. casei（干酪乳杆菌），通过调节色氨酸代谢物来减弱CIA

       总之，SIN 能以肠道微生物群依赖的方式显著缓解 RA 的关节损伤和炎症。研究发现，SIN 可改善微生物失衡和肠道屏障功能障碍，并显著丰富肠道微生物群衍生的色氨酸代谢物（IA、IAA 和 IPA）。给 CIA 大鼠补充色氨酸代谢物可通过激活 AhR 来调节 NF-κB 和 MAPK 磷酸化，从而减轻与 RA 相关的炎症和免疫反应。此外，SIN 还能缓解关节炎症状，其富含的两种有益乳酸杆菌（L. paracasei 和 L. casei）能减轻 RA 症状，而这两种乳酸杆菌是由单菌落群显示的。目前的研究提出了 SIN 对 RA 具有保护作用的新机制，这些数据可能会通过靶向关键代谢物或细菌为 RA 提供一种有前景的治疗方法。

图9 图像摘要

实验方法

关节炎动物模型构建，免疫器官指数，细胞因子检测，组织病理学分析，色氨酸代谢物（Try-M）对大鼠干预研究，粪便微生物移植（FMT），细胞培养和处理，表面等离子体共振（SPR）结合与分子对接实验，流式细胞术，乳酸杆菌处理大鼠，代谢组，色氨酸代谢物靶向定量，肠道微生物组，Real-time PCR，WB

参考文献

Jiang ZM, Zeng SL, Huang TQ, Lin Y, Wang FF, Gao XJ, Li J, Li P, Liu EH. Sinomenine ameliorates rheumatoid arthritis by modulating tryptophan metabolism and activating aryl hydrocarbon receptor via gut microbiota regulation. Sci Bull (Beijing). 2023 Jul 30;68(14):1540-1555. doi: 10.1016/j.scib.2023.06.027. Epub 2023 Jun 28. PMID: 37422372.