OIP5-AS1的m6A修饰介导hnRNPA1泛素化和降解，促进胃癌的糖酵解、肿瘤发生和转移
opa相互作用蛋白5反义转录物1 （OIP5-AS1）在胃癌等多种肿瘤的发生、发展中起重要作用。然而，OIP5-AS1的详细分子机制尚未完全阐明。在本研究中，作者发现OIP5-AS1在胃癌组织和细胞系中特异性高表达，并与不良预后相关。OIP5-AS1的缺失抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮-间充质转化（EMT）和糖酵解，而OIP5-AS1的异位表达则产生相反的影响。同时，敲低OIP5-AS1抑制了患者来源的异种移植模型的肿瘤生长，并抑制了肿瘤转移。机制上，IGF2BP3通过OIP5-AS1上的N6 -甲基腺苷（m6A）修饰位点与OIP5-AS1结合，从而稳定OIP5-AS1。此外，OIP5-AS1阻止Trim21介导的hnRNPA1泛素化降解，稳定hnRNPA1蛋白，并通过调控PKM2信号通路促进胃癌恶性进展。该研究于2023年10月发表在《Gastric Cancer》，IF：7.4。
技术路线
主要研究结果
1. OIP5 - AS1的高表达与胃癌患者的临床指标密切相关
初步分析GEPIA STAD数据库，发现与癌旁非肿瘤组织相比，OIP5-AS1在胃癌组织中显著升高（图1A）。采用qRT-PCR检测OIP5-AS1在90对胃癌及相应的癌旁组织中的表达，发现OIP5-AS1在肿瘤组织中的表达高于正常组织（图1B）。检测OIP5-AS1表达与胃癌患者临床病理参数之间的关系，发现OIP5-AS1与TNM阶段、T阶段和远处转移呈正相关（图1C-E）。在年龄、性别和淋巴结转移方面未观察到显著差异（图1E-G）。此外，Kaplan-Meier分析表明，与OIP5-AS1表达水平较低的患者相比，OIP5-AS1表达水平较高的患者总体生存率较差（图1H）。与人正常胃黏膜细胞株GES-1相比，OIP5-AS1在胃癌细胞株（MGC-803、BGC-823、SGC-7901和AGS）中的表达水平显著上调（图1I），与临床结果一致。最后，使用FISH和亚细胞分离实验来验证OIP5-AS1在胃癌细胞中是一个细胞质lncRNA（图1J， K）。
图1. OIP5-AS1的高表达水平与胃癌患者的临床参数密切相关
2. OIP5 - AS1加速体外细胞生长和集落形成以及体内肿瘤形成
为研究OIP5-AS1在GC细胞中的调控作用，使用慢病毒载体在MGC-803细胞中稳定过表达OIP5-AS1，并在AGS细胞中使用两个不同的shRNA序列稳定沉默OIP5-AS1（图2A）。CCK-8和EdU分析显示，敲除OIP5-AS1显著减弱细胞增殖能力，而过表达OIP5-AS1则促进细胞增殖（图2B-D）。同样，OIP5-AS1缺陷降低细胞的克隆形成能力，而OIP5-AS1过表达促进GC细胞的生长（图2E，F）。此外，下调OIP5-AS1显著降低Cyclin D1和CDK2的表达，同时增加p21和p27的表达，这在OIP5-AS1过表达细胞系中得到验证（图2G）。为验证OIP5-AS1在体内对胃癌肿瘤生长的影响，利用新鲜胃癌组织建立患者来源的异种移植模型，尾静脉接种sh-OIP5-AS1或shNC慢病毒。沉默OIP5-AS1组产生的肿瘤体积和重量均显著低于对照组（图2H-K）。此外，IHC分析显示，sh- OIP5-AS1处理组中增殖标志物PCNA的表达降低（图2L）。此外，与对照组相比，OIP5-AS1被阻断后，移植瘤中OIP5-AS1的表达明显下调（图2M）。
图2. OIP5-AS1在体外促进细胞生长和集落形成，在体内促进肿瘤形成
3. OIP5-AS1在体外促进胃癌细胞的迁移和侵袭，在体内促进胃癌移植瘤的转移
随后，通过划痕实验和transwell侵袭实验来研究OIP5-AS1在胃癌细胞转移行为中的作用。如图3A所示，沉默OIP5-AS1的表达被显著抑制，而强制OIP5-AS1的表达增强GC细胞的迁移能力。同样，OIP5-AS1沉默细胞的侵袭速度明显较慢，而OIP5-AS1过表达细胞的侵袭速度比相应对照细胞快（图3B）。western blot结果显示，沉默OIP5-AS1上调上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白e -钙黏蛋白（E-cadherin）表达，下调n-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和slug表达，但过表达OIP5-AS1具有相反的作用（图3C）。为研究OIP5-AS1在体内肿瘤转移中的作用，作者将荧光素酶标记的Ctrl-、OIP5-AS1-、sh-OIP5-AS1-或shNC转染细胞注射到NOD-SCID小鼠的尾静脉中。图3D， E 显示OIP5-AS1沉默组小鼠肺内转移性生长显著减少，而OIP5-AS1过表达组小鼠肺内转移性生长显著增加。
图3. OIP5-AS1在体外促进胃癌细胞的迁移和侵袭，在体内促进移植瘤的转移
4. OIP5 - AS1调控胃癌细胞中的Warburg效应
进行葡萄糖摄取、乳酸和海马实验检测OIP5-AS1是否影响有氧糖酵解。正如预期的那样，沉默OIP5-AS1的细胞显示出葡萄糖摄取和乳酸生成的显著下降。然而，过表达OIP5-AS1的细胞增加葡萄糖摄取和乳酸生成（图4A，B）。此外，敲低OIP5-AS1抑制糖酵解和糖酵解能力，而OIP5-AS1过表达显著增强GC细胞的糖酵解和糖酵解能力（图4C）。OIP5-AS1敲低显著增加ATP生成和最大呼吸，而强制表达OIP5-AS1可降低这些因子（图4D）。采用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）评估OIP5-AS1是否通过调节有氧糖酵解影响细胞增殖和转移。在CCK-8和Transwell侵袭实验中，2-DG处理抑制OIP5-AS1敲除和OIP5-AS1过表达细胞的增殖和转移（图4E，F）。
图4. OIP5-AS1调控GC细胞的Warburg效应
5. IGF2BP3以依赖m6A的方式调控OIP5 - AS1的表达
在AGS细胞中，IGF2BP3直接与OIP5-AS1结合，如RNA下拉实验所示（图5A）。随后的RIP实验验证IGF2BP3抗体在AGS细胞中对OIP5-AS1的富集，证实IGF2BP3与OIP5-AS1之间的相互作用（图5B）。利用SRAMP（m6A修饰位点预测因子）预测OIP5-AS1序列中的经典m6A基序（GAACT），从而推测OIP5-AS1在AGS细胞中可能存在m6A修饰。采用MeRIP实验验证OIP5-AS1中m6A修饰（图5C）。此外，RNA pull-down实验显示，突变OIP5-AS1中的m6A基序后，IGF2BP3与OIP5-AS1的结合显著下降，表明IGF2BP3与OIP5-AS1的结合依赖于m6A修饰（图5D）。METTL3是一种重要的m6A甲基转移酶，被称为m6A writer，在胃癌组织中高表达，与患者的不良预后相关。因此，在GC细胞中敲低IGF2BP3或METTL3，以研究IGF2BP3是否调节OIP5-AS1的稳定性，发现IGF2BP3的表达显著降低（图5E）。然后，使用转录抑制剂Actinomycin D处理来研究OIP5-AS1随时间的稳定性。IGF2BP3的沉默导致OIP5-AS1的稳定性和半衰期明显降低（图5F）。同样，METTL3的缺失显著缩短OIP5-AS1的半衰期（图5F）。与对照组相比，在使用IGF2BP3或m6A特异性抗体进行RIP检测时，METTL3敲低显著影响OIP5-AS1的富集（图5G，H）。
图5. IGF2BP3以依赖m6A的方式调控OIP5-AS1的表达
6. IGF2BP3通过OIP5‑AS1调节GC细胞的生物活性
将siIGF2BP3和OIP5-AS1慢病毒共转染AGS细胞，探讨IGF2BP3是否参与OIP5-AS1介导的胃癌细胞生物学功能。qRT-PCR结果表明，在GC细胞中过表达OIP5-AS1后，si-IGF2BP3转染细胞中的OIP5-AS1表达水平部分升高（图6A）。IGF2BP3敲低显著抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而这些作用可被OIP5-AS1上调逆转（图6B-G、7A、B）。此外，IGF2BP3沉默细胞中葡萄糖摄取、乳酸生成、糖酵解、糖酵解能力下降、ATP生成增加和最大呼吸作用可被OIP5-AS1过表达逆转（图7C-E）。这些结果表明，OIP5-AS1抑制剂部分介导IGF2BP3的癌基因效应。
图6. IGF2BP3通过OIP5- AS1调节GC细胞的生物活性
图7. IGF2BP3通过OIP5-AS1调控GC细胞侵袭、EMT和葡萄糖代谢
7. OIP5 - AS1通过阻断Trim21介导的hnRNPA1泛素化和降解来增强hnRNPA1的稳定性
RNA pull-down和RIP实验证实OIP5-AS1可能与hnRNPA1相互作用（图8A，B）。根据截断实验，hnRNPA1与OIP5-AS1的0 ~ 500 nt片段结合（图8C）。检测敲低OIP5-AS1的AGS细胞和过表达OIP5-AS1的MGC-803细胞中hnRNPA1的表达水平，进一步阐明OIP5-AS1与hnRNPA1相互作用的分子机制。观察到，在OIP5-AS1沉默和OIP5-AS1过表达的细胞中，hnRNPA1 mRNA水平保持不变（图8D）。然而，在OIP5-AS1下调的细胞中，hnRNPA1蛋白水平显著降低，而在OIP5-AS1上调的细胞中，hnRNPA1蛋白水平显著升高（图8E）。蛋白稳定性实验显示，敲低OIP5-AS1可以显著缩短GC细胞中hnRNPA1蛋白的半衰期，而过表达OIP5-AS1则显著增加hnRNPA1蛋白的半衰期（图8F，G）。此外，当使用蛋白酶体抑制剂MG132处理GC细胞时，OIP5-AS1沉默后hnRNPA1蛋白水平的下降被减弱，而OIP5-AS1过表达则有相反的效果（图8H）。此外，OIP5-AS1敲低细胞的hnRNPA1泛素化水平增加，而OIP5-AS1过表达细胞的hnRNPA1泛素化水平降低（图8I），表明OIP5-AS1参与胃癌细胞中hnRNPA1的蛋白酶体依赖性降解。此外，OIP5-AS1敲低增强PKM1的表达，同时降低PKM2的表达（图8J）。相反，强制表达OIP5-AS1降低PKM1的表达，增加PKM2的表达（图8J）。如图8K所示，与GES-1细胞相比，GC细胞系中Trim21的表达水平低，hnRNPA1的表达水平高。此外，尽管OIP5-AS1的表达水平没有显著差异，但在Trim21过表达的细胞中，hnRNPA1的表达水平被下调（图8L，M）。进行CO-IP检测，观察到在AGS细胞中，Trim21与hnRNPA1结合（图8N）。此外，当OIP5-AS1被沉默或过表达时，检测Trim21和hnRNPA1之间的关联。OIP5-AS1的下调显著改善，而OIP5-AS1的上调降低Trim21和hnRNPA1的相互作用（图8O）。
图8. OIP5-AS1通过阻断Trim21介导的hnRNPA1泛素化和降解增强hnRNPA1的稳定性
8. hnRNPA1介导胃癌细胞中OIP5-AS1的调控
为验证OIP5-AS1是否影响HNRNPA1调控的胃癌细胞功能，进行挽救实验。蛋白质印迹分析显示，sh-OIP5- AS1下调的hnRNPA1和PKM2蛋白表达以及上调的PKM1蛋白表达可以被hnRNPA1过表达所逆转（图9A），但在hnRNPA1沉默后，OIP5-AS1过表达所诱导的hnRNPA1和PKM2蛋白表达增加以及PKM1蛋白表达降低被消除（图11A）。hnRNPA1的强制表达部分恢复OIP5-AS1敲低介导的GC细胞生长、迁移和侵袭的抑制（图9B-G，10A，B），而hnRNPA1的抑制部分逆转OIP5-AS1上调诱导的GC细胞生长和转移的促进作用（图11B-G，12A，B）。此外，hnRNPA1的刺激恢复降低的葡萄糖摄取、乳酸生成、糖酵解和糖酵解能力。同时增强OIP5-AS1沉默引起的ATP生成和最大呼吸（图10C-F）。然而，hnRNPA1下调消除OIP5-AS1过表达引起的葡萄糖摄取、乳酸生成、糖酵解和糖酵解能力升高，并降低ATP生成和最大呼吸（图12C-F）。综上所述，OIP5-AS1通过竞争性结合hnRNPA1发挥致癌作用。
图9. hnRNPA1介导GC细胞中OIP5-AS1的调控
图10. hnRNPA1介导OIP5-AS1对GC细胞侵袭、EMT和糖代谢的调节
图11. 沉默hnRNPA1抑制OIP5- AS1对胃癌细胞生长和迁移的促进作用
图12. 敲低hnRNPA1可逆转OIP5-AS1对MGC823细胞侵袭、EMT和糖酵解的促进作用
结论
综上所述，本研究发现经m6A修饰稳定的OIP5-AS1通过抑制Trim21介导的HNRNPA1泛素化和降解促进胃癌进展，导致PKM2形成。这些发现有助于我们对胃癌中IGF2BP3/OIP5-AS1/Trim21/hnRNPA1/PKM2轴的理解，并提示OIP5-AS1可能为胃癌的诊断和治疗开辟一个潜在的新视角。
实验方法
质粒，慢病毒和转染，细胞培养，qRT‑PCR，WB，IHC和HE染色，CCK-8，EdU实验，菌落形成，Transwell侵袭实验，伤口愈合实验，RIP，Co‑IP，RNA pull down和截断实验，RNA稳定性测定，泛素化分析，MeRIP，葡萄糖摄取和乳酸测定，亚细胞RNA分离，细胞外酸化速率和耗氧量测定，患者来源的异种移植模型，体内动物模型转移实验，蛋白质稳定性测定
参考文献
Xie R, Liu L, Lu X, He C, Yao H, Li G. N6-methyladenosine modification of OIP5-AS1 promotes glycolysis, tumorigenesis, and metastasis of gastric cancer by inhibiting Trim21-mediated hnRNPA1 ubiquitination and degradation. Gastric Cancer. 2023 Oct 28. doi: 10.1007/s10120-023-01437-7. Epub ahead of print. PMID: 37897508.