FAM171B通过稳定波形蛋白并增强CCL2介导的TAM浸润促进膀胱癌进展
膀胱癌是世界范围内第二大常见的泌尿系统恶性肿瘤，严重威胁人类健康。膀胱尿路上皮癌（BLCA）是膀胱癌最常见的病理类型，占所有膀胱癌的90%。侵袭和转移是膀胱癌患者预后不良的主要原因。虽然非肌层浸润性膀胱癌很少发生转移，但约有15-20%进展为肌层浸润性膀胱癌。肌层浸润性膀胱癌转移风险高，5年生存率明显低于非肌层浸润性膀胱癌。免疫疗法带来了有希望的生存获益，然而肌层浸润性膀胱癌的治疗仍然具有挑战性，因其有较高的复发率。因此，深入了解膀胱癌进展的分子机制对于开发新的治疗方法至关重要。
上皮-间充质转化（EMT）是驱动远处转移的主要机制，是膀胱癌患者死亡的主要原因。波形蛋白（VIM）是间充质细胞的关键标志物，在膀胱癌的生长、侵袭和不良预后相关。膀胱癌细胞EMT过程中波形蛋白表达上调，提示靶向波形蛋白有望成为阻止膀胱癌转移进展的一种治疗策略。肿瘤微环境（TME）由多种促进肿瘤进展的基质细胞组成。这些细胞中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）构成了最丰富的免疫细胞群。TAMs是抗肿瘤免疫的主要障碍，是免疫治疗失败的关键因素。值得注意的是，趋化因子配体2（CCL2）在巨噬细胞募集中起关键作用，并参与癌细胞增殖、癌症转移和免疫抑制性TME的建立。了解CCL2在膀胱癌中持续表达的分子机制可以为开发有效的抗CCL2治疗提供新的理论基础。FAM171B是一种广泛表达且进化保守的蛋白。在人结直肠癌细胞中，FAM171B被鉴定为miR-483-3p的功能靶点，参与调控奥沙利铂耐药。然而FAM171B的结构、功能和在癌症中的具体作用的理解仍然有限。该研究发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：12.658。
技术路线
主要研究结果
1. FAM171B表达与BLCA患者肿瘤进展及M2 TAM浸润呈正相关
为了评估FAM171B在膀胱癌中的临床意义，研究者利用TCGA数据库、GEO数据库和研究者的临床中心的数据进行了全面的分析。首先，研究者分析了TCGA-BLCA队列中19个肿瘤组织和匹配的癌旁组织的RNA测序数据。结果显示，FAM171B在BLCA肿瘤组织中的表达水平高于配对的癌旁组织（图1A）。随后，研究者对包含70例BLCA患者临床标本的组织微阵列进行免疫组织化学染色，以定量FAM171B蛋白表达。代表性图像提供于图1B中。根据从组织微阵列分析获得的临床信息和IHC染色结果，研究者确定了高FAM171B蛋白水平与晚期T分期和晚期N分期之间的显著相关性（图1C，D）。对TCGA数据库中406例BLCA组织的RNA测序数据进行的分析获得了一致的结果（图1J-L）。这些结果提示，FAM171B表达水平升高与较晚期的临床病理分级和分期相关。此外，研究者的预后分析表明，FAM171B蛋白水平升高的BLCA患者显示出显著较低的总生存（OS）率、无进展生存（PFS）率和疾病特异性生存（DSS）率（图1E-G）。然而，无病生存(DFS)率的差异无统计学意义（图1H）。为了验证FAM171B在膀胱癌中的表达与生存率之间的关系，研究者使用了来自GEO数据库的613例患者的完整队列。结果表明，在该队列中，FAM171B蛋白水平升高与较差的OS结局显著相关（图1I）。此外，对TCGA-BLCA队列中的免疫细胞浸润进行的分析表明，FAM171B表达与巨噬细胞浸润的相关性最强（图1M）。研究者进一步研究了影响单核/巨噬细胞的趋化因子表达与FAM171B的关系。在评估的趋化因子中，只有CCL2与FAM171B具有统计学显著相关性（图1N）。对于FAM171B与BLCA中巨噬细胞表型之间的关联，基于QUANTISEQ算法的免疫分析显示FAM171B表达与M2型巨噬细胞之间存在显著的正相关（图1P），而与M1型巨噬细胞之间没有显著的相关性（图10）。在组织芯片中评估FAM171B与基质细胞浸润的关系。代表性图像如图1Q所示。根据免疫组织化学染色结果，将所有样本分为FAM171B高表达组和低表达组。通过多次免疫荧光分析，研究者发现FAM171B蛋白的表达水平与CD206+ M2巨噬细胞的浸润显著正相关，而与CD8+ T细胞的浸润呈负相关。然而，在α-SMA+成纤维细胞浸润方面，研究者没有检测到FAM171B高表达组和低表达组之间的显著差异（图1R）。综上所述，研究者的研究结果表明，FAM171B与M2型巨噬细胞的浸润相关，并可能作为膀胱癌的潜在预后指标。
图1 FAM171B表达与BLCA患者肿瘤进展及M2 TAM浸润呈正相关
2. FAM171B促进膀胱癌细胞的恶性表型
Chronos依赖性评分显示，在CCLE数据库中28个人膀胱尿路上皮癌细胞系中，T24细胞系的评分最低，表明FAM171B在T24细胞中比在其他细胞系中更关键（图2A）。除T24人膀胱尿路上皮癌细胞外，研究者还纳入了MB49小鼠膀胱尿路上皮癌细胞。为了研究FAM171B在膀胱癌细胞中的分子功能，研究者在T24和MB49细胞中敲低和过表达FAM171B，并通过Western blot分析验证其效率（图2B）。CCK-8法检测FAM171B对T24和MB49细胞活力的影响。两个细胞系的结果表明，在96 h后，FAM171B过表达细胞的活力增加，而FAM171B敲低细胞的活力降低（图2E）。此外，集落形成实验结果表明，过表达FAM171B后，T24和MB49细胞的集落形成能力显著增加，而敲低FAM171B导致集落形成能力下降（图2C，D）。这些体外研究结果表明，FAM171B基因的表达影响细胞增殖，尽管细胞活力的差异仅在96小时后才变得有统计学意义。此外，研究者的目的是通过伤口愈合和transwell侵袭来阐明FAM171B对膀胱癌细胞转移的影响。Transwell侵袭实验结果显示，与相应的对照组相比，敲低FAM171B的T24和MB49细胞组中下室的迁移细胞数量减少，而过表达FAM171B时，下室的迁移细胞数量增加（图2F，G）。同样，敲低FAM171B降低了T24和MB49细胞的伤口愈合效果。而FAM171B过表达显著加速了细胞迁移（图2H，I）。这些体外结果强烈表明FAM171B促进了膀胱癌细胞的恶性表型。
图2 FAM171B促进膀胱癌细胞的恶性表型
3. RNA测序T24细胞以研究FAM171B的功能
为了研究FAM171B在膀胱癌细胞中的作用，研究者对FAM171B过表达和对照T24细胞进行了RNA测序。样本间相关性的热图表明，FAM171B过表达组和对照组之间的mRNA表达水平存在显著差异，而各组内的差异相对较小（图3A）。通过对测序数据的分析，研究者确定了244个差异表达基因。火山图显示了一些差异表达的基因；上调基因包括CDRT4、APLN和CCL2，下调基因包括RAB4B、CACNA1S和IL1A（图3B）。此外，6个样本的基因表达热图显示，亚组间差异表达基因的表达存在显著差异（图3C）。为了进一步了解FAM171B在T24细胞中的具体功能，研究者进行了GO分析，KEGG分析和eggNOG分析。在T24细胞系中，GO分析显示FAM171B与炎症反应和细胞因子介导的信号通路等生物学过程显著相关（图3D）。在细胞成分类别中，FAM171B与细胞外间隙和过时的细胞外区域部分显著相关（图3E）。在分子功能方面，FAM171B与肿瘤坏死因子激活受体活性和细胞因子活性显著相关（图3F）。KEGG分析表明，FAM171B主要与IL-17信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号通路相关（图3G）。此外，eggNOG功能分析显示FAM171B主要参与信号转导机制、复制、重组、修复和细胞骨架相关功能（图3H）。综上所述，RNA测序的结果全面揭示了FAM171B在人膀胱癌T24细胞系中的不同功能，表明其功能主要涉及细胞因子，信号通路转导和细胞骨架相关过程。
图3 RNA测序T24细胞以研究FAM171B的功能
4. 膀胱癌细胞中FAM171B与波形蛋白、HNRNPU相互作用
为了阐明FAM171B在蛋白质水平上的分子作用，研究者通过免疫共沉淀和质谱鉴定了膀胱癌细胞中FAM171B的主要相互作用蛋白。使用DYKDDDDK磁珠从过表达标记FAM171B的T24细胞和对照细胞中收集含有FAM171B相互作用蛋白的上清液。随后，利用质谱鉴定出特定的正相互作用蛋白（图4A，B）。质谱鉴定出得分最高的相互作用蛋白如图4C所示。利用STRING数据库获得FAM171B与其相互作用蛋白之间的相互作用。随后构建FAM171B的蛋白相互作用网络，如图4D所示。其中评分最高的VIM和HNRNPU被鉴定为T24细胞中与FAM171B相互作用的关键蛋白。人类FAM171B蛋白的预测结构来自AlphaFold网站（图4E）。为了进一步探索蛋白质之间的相互作用，研究者进行了模拟，以可视化FAM171B与波形蛋白和HNRNPU的对接模式（图4J，L）。免疫荧光结果显示FAM171B蛋白在T24细胞的细胞质和细胞核中均有表达（图4F）。免疫荧光双标染色和共定位分析验证FAM171B与波形蛋白/HNRNPU的相互作用。双重免疫荧光染色结果表明，FAM171B-波形蛋白复合体主要定位于细胞质（图4G），而FAM171B- HNRNPU复合体主要定位于细胞核（图4H）。Image J软件共定位分析证实FAM171B与波形蛋白和HNRNPU存在空间共表达（图4J，K）。综上所述，这些发现强调了波形蛋白和HNRNPU是膀胱癌细胞中FAM171B的主要相互作用蛋白。
图4 膀胱癌细胞中FAM171B与波形蛋白、HNRNPU相互作用
5. FAM171B通过稳定波形蛋白促进膀胱癌的进展
波形蛋白是EMT的蛋白标记物，EMT是癌细胞获得迁移和侵袭表型的过程。因此，研究者检测了FAM171B对T24细胞EMT过程的影响。研究者观察到FAM171B过表达的细胞中波形蛋白水平明显升高，而FAM171B敲低的细胞中波形蛋白水平较对照组细胞降低。然而，在FAM171B过表达或敲低的T24细胞中，e-钙黏蛋白和n-钙黏蛋白的表达没有显著变化（图5A）。此外，通过对组织芯片样本的免疫组织化学染色分析，研究者发现FAM171B和波形蛋白的蛋白水平呈正相关（图5K，L）。之前的结果表明FAM171B和波形蛋白在膀胱癌细胞中存在相互作用。蛋白质印迹分析表明，过表达FAM171B后的波形蛋白水平增加，可以通过Vimentin-IN-1（一种诱导波形蛋白降解的波形蛋白抑制剂）处理逆转（图5B）。为了研究FAM171B是否通过vimentin增强膀胱癌细胞的侵袭和迁移，研究者用Vimentin-IN-1处理细胞，进行划痕实验和transwell侵袭实验。Transwell侵袭实验结果表明，Vimentin-IN-1部分抑制了FAM171B过表达引起的T24细胞侵袭能力的增加（图5C，D）。同样，划痕实验结果表明，Vimentin-IN-1处理降低了FAM171B过表达引起的T24细胞迁移率的增加（图5E，F）。鬼笔环肽染色结果表明，高效过表达FAM171B导致膀胱癌细胞的形态发生变化，从上皮形态转变为间质形态（图5G）。接下来，研究者使用CHX抑制膀胱癌细胞的蛋白质合成，随后通过蛋白质印迹法检测剩余的波形蛋白的水平。CHX处理10 h后，FAM171b过表达细胞的波形蛋白水平高于对照细胞（图5H）。经过分析，研究者观察到过表达FAM171B使内源性波形蛋白的半衰期从6 h延长到9 h，表明FAM171B可以稳定波形蛋白（图5I）。随后，研究者研究了FAM171B是否影响T24细胞中波形蛋白的泛素化。结果表明，FAM171B过表达导致波形蛋白泛素化水平降低，而FAM171B敲低导致泛素化水平升高（图5J）。为了进一步验证FAM171B/波形蛋白在体内的作用，研究者使用T24细胞建立了小鼠皮下异种移植模型（图5M）。小鼠异种移植瘤的IHC染色分析表明，在OE-FAM171B组中FAM171B的表达显著增加，证实了模型的成功建立（图5N，R）。此外，FAM171B上调了体内波形蛋白的表达，这一作用被Vimentin-IN-1处理逆转，与体外研究结果相似（图5N，S）。而Vimentin-IN-1处理可有效缓解这一效应（图5O，P）。此外，在小鼠体重方面，Vimentin-IN-1处理可部分缓解FAM171B过表达导致的体重下降（图5Q）。综上所述，这些结果证实了FAM171B在体内外通过稳定波形蛋白促进膀胱癌的进展。
图5 FAM171B通过稳定波形蛋白促进膀胱癌的进展
6. FAM171B通过HNRNPU调控CCL2，促进膀胱癌中TAM的迁移和浸润
研究者进行体内和体外实验，研究FAM171B和HNRNPU对膀胱癌细胞CCL2表达的影响。ELISA结果显示，在MB49小鼠膀胱癌细胞中，过表达FAM171B增加了CCL2的分泌，敲低FAM171B减少了CCL2的分泌（图6A）。RIP实验结果证实了MB49细胞中HNRNPU与CCL2前体RNA的结合（图6B）。与之前的研究结果一致，在MB49细胞中敲低HNRNPU可以增加CCL2前体RNA的水平并降低CCL2 RNA的水平（图6C）。ELISA结果也证实，敲低HNRNPU降低了MB49细胞中CCL2的分泌（图6D）。为了研究FAM171B和HNRNPU是通过共同途径还是不同途径影响CCL2分泌，研究者在FAM171B过表达的MB49细胞中分别进行了HNRNPU敲低干预或CCR2抑制剂处理（图6E）。ELISA结果显示，敲低HNRNPU减弱了FAM171B过表达引起的CCL2分泌增加（图6F）。CCL2是诱导单核细胞和巨噬细胞特异性趋化的众所周知的趋化因子。为了探讨FAM171B和HNRNPU对巨噬细胞趋化的影响，研究者将RAW264.7小鼠巨噬细胞与不同分组的MB49小鼠膀胱癌细胞共培养。趋化实验结果表明，在共培养系统中，FAM171B过表达增强了巨噬细胞对肿瘤细胞的趋化，而HNRNPU敲低和CCR2抑制部分减弱了这一作用（图6G，H）。为了进一步验证FAM171B/CCL2调控在体内的作用，研究者使用MB49膀胱癌细胞建立了小鼠皮下移植瘤模型（图6I）。免疫组化分析（图6J，O）和流式细胞术（图6K，P）结果证实，FAM171B过表达显著增加了肿瘤组织中的巨噬细胞浸润，而CCR2抑制剂治疗有效抑制了这一作用。重要的是，CCR2抑制剂还部分逆转了FAM171B过表达引起的肿瘤生长增加（图6L，M），并减轻了体重减轻（图6N）。综上所述，这些实验表明FAM171B通过HNRNPU促进CCL2分泌，从而导致巨噬细胞浸润和肿瘤进展。
图6 FAM171B通过HNRNPU调控CCL2，促进膀胱癌中TAM的迁移和浸润
7. FAM171B通过调控CCL2的表达增强TAM向M2表型的极化
研究者使用双重免疫荧光染色和流式细胞术在体内和体外研究FAM171B/CCL2调节对膀胱癌相关巨噬细胞极化的影响。流式细胞术分析显示，与对照组相比，与过表达FAM171b的MB49细胞共培养时，CD206阳性的RAW264.7巨噬细胞比例增加。敲低HNRNPU和CCR2抑制剂的处理部分逆转了FAM171B过表达诱导的CD206阳性的增加（图7A，B）。在IHC中，研究者使用了另一种M2巨噬细胞标志物Arg1，并获得了类似的结果（图7C，D）。此外，研究者观察到在共培养系统的培养基中，EGF和IL-10的分泌显著增加，这两种标志物都是M2巨噬细胞的标志物。有趣的是，THP-1来源的巨噬细胞与过表达FAM171b的T24细胞共培养后，其聚集性增强。为了进一步验证FAM171B和CCL2在体内的作用，研究者检测了小鼠移植瘤中M2型巨噬细胞的比例。与体外实验结果一致，小鼠FAM171B过表达组皮下肿瘤中M2型巨噬细胞的比例增加，CCR2抑制剂处理显著逆转了FAM171B过表达的这一作用（图7G-J）。综上所述，这些实验结果证实了FAM171B具有通过CCL2通路促进TME中TAM的M2极化的能力。
图7 FAM171B通过调控CCL2的表达增强TAM向M2表型的极化
结论
研究者发现FAM171B是一个有效的促进膀胱癌进展的因子，并且与晚期癌症分期和不良预后呈正相关。此外，FAM171B通过与波形蛋白相互作用，增强其稳定性，发挥稳定作用，导致肿瘤进展。此外，FAM171B通过与HNRNPU相互作用增强CCL2 mRNA的剪接，最终导致TAM的募集并向M2表型极化。基于研究者的综合研究结果，FAM171B作为膀胱癌诊断和治疗干预的生物标志物具有巨大的潜力。
机制图
实验方法
TCGA和GEO数据的生物信息学分析，细胞培养，转染，细胞增殖测定和集落形成测定，鬼笔环肽染色，RNA 免疫沉淀（RIP），qRT-PCR，蛋白质印迹，免疫荧光染色（IF），免疫组织化学染色（IHC），HE染色，免疫共沉淀，流式细胞术，ELISA，伤口愈合试验，transwell侵袭试验，RNA测序、数据处理和基因差异分析，动物实验，小鼠异种移植肿瘤模型
参考文献
Hu WM, Li M, Ning JZ, Tang YQ, Song TB, Li LZ, Zou F, Cheng F, Yu WM. FAM171B stabilizes vimentin and enhances CCL2-mediated TAM infiltration to promote bladder cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Nov 2;42(1):290. doi: 10.1186/s13046-023-02860-5.