METTL5通过促进USP5翻译稳定c-Myc来重编程葡萄糖代谢并促进肝细胞癌进展
METTL5是一种18S rRNA甲基转移酶，能够提高癌症细胞中的蛋白质合成活性，对肿瘤发生和细胞命运至关重要。先前的研究表明，缺乏METTL5的小鼠胚胎干细胞（mESC）具有较低的分化潜力和蛋白质合成速率。此外，据报道，METTL5促进乳腺癌和胰腺癌的肿瘤发生，并且METTL5缺陷导致整体蛋白质合成和S6K激活明显降低。尽管已经证明METTL5在调节生物过程中起关键作用，但其在调控HCC复杂代谢重编程中的功能和分子机制仍不完全清楚。因此，为了确定METTL5与葡萄糖代谢的重编程是否存在显著关联，作者联合分析了转录组学和代谢组学的多个层面数据，旨在确定METTL5在HCC中的临床相关性，并阐明METTL5介导的葡萄糖代谢和HCC发展的分子过程。该研究于2023年3月发表在《Cancer Communications》，IF=16.2。
技术路线
主要研究内容
1. METTL5在HCC中上调，与预后不良相关
TCGA-LIHC数据库和GTEx数据库分析显示，METTL5转录水平在HCC中显著上调（图1A）。从GEO数据库下载的微阵列数据同样显示METTL5在HCC中过表达（图1B）。此外，作者发现METTL5转录水平在多种癌症中显著升高，尤其是HCC。根据Kaplan-Meier生存曲线，METTL5高表达的HCC患者预后较差（图1C）。对UALCAN数据库的分析显示，METTL5转录水平与肿瘤分级和分期之间存在显著关联（图1D）。从武汉大学中南医院样本库随机抽取的80对HCC组织及癌旁正常组织中METTL5表达的qRT-PCR分析显示，HCC中METTL5转录本水平显著上调，METTL5表达与肿瘤大小和TNM分期相关（图1E和附表S3）。多因素Cox比例风险回归分析显示，表现为METTL5过表达的HCC患者总生存期较短，METTL5是HCC患者生存期较短的独立危险因素（图1F）。根据中值将HCC患者分为低表达和高表达的METTL5亚组后，Kaplan-Meier分析显示，高METTL5表达与HCC患者的不良预后密切相关（图1K）。Western blotting分析和免疫组化证实了HCC组织中METTL5蛋白水平的上调（图1H-I）。与MIHA人肝细胞的表达相比，5种HCC细胞系中的METTL5 mRNA和蛋白水平增加（图1J-K）。共聚焦激光扫描显微镜发现，HCC细胞中的METTL5蛋白（红色荧光）主要是细胞质（图1L）。这些发现表明，METTL5可能作为诊断和治疗HCC的潜在生物标志物。
图1 肝细胞癌中METTL5的上调。
2. METTL5增强了HCC细胞中的Warburg效应
作者首先使用CRISPR/Cas9技术构建了稳定的METTL5敲除（KO）HCC细胞系（Huh-7和HCC-LM3），以研究METTL5在HCC中的潜在分子机制（图2A）。然后，作者构建了一个Hep-G2细胞模型，该模型通过慢病毒转导稳定地过表达METTL5。进行RNA-seq以筛选METTL5敲除后在HCC细胞系中差异表达的基因。差异表达mRNA的KEGG通路分析显示糖酵解有相当大的富集（图2B）。对转录组数据进行的GSEA显示，METTL5大大增加了MYC信号通路和糖酵解信号通路。因此，对TCGA数据库的GSEA分析显示METTL5与MYC信号通路之间存在正相关。此外，作者采用基于高效液相色谱-串联质谱的非靶向代谢组学方法检测代谢物。METTL5-KO细胞的代谢组与METTL5-WT细胞的代谢组有显著差异。根据代谢组学分析，METTL5-KO在代谢方面产生了显著的变化，包括更高水平的三羧酸（TCA）循环代谢物和更低的乳酸水平（图2C）。随后，作者在RNA-seq数据中检测到与糖酵解相关的差异表达基因。HCC细胞中METTL5敲除显著抑制糖酵解基因乳酸脱氢酶A（LDHA）、烯醇化酶1（ENO1）、磷酸丙糖异构酶1（TPI1）、溶质载体家族2成员1（SLC2A1）和丙酮酸激酶M2（PKM2）在mRNA和蛋白水平上的表达，而METTL5过表达则发挥相反作用（图2D）。此外，对TCGA-LIHC数据库和80对HCC组织的分析显示，METTL5转录水平与糖酵解基因表达水平之间存在显著的正相关。
图2 METTL5增强了对HCC细胞的Warburg效应。
随后，作者测量了敲除METTL5后的葡萄糖摄取和乳酸产生，以系统地研究METTL5激活是否促进HCC中的有氧糖酵解（Warburg效应）。这种糖酵解表型被葡萄糖吸收和乳酸生成减少所抑制。正如预期的那样，沉默METTL5显著降低了葡萄糖摄取和乳酸生成。已经观察到酸性肿瘤微环境（较低的pH值）是由乳酸过量产生引起的，这促使肿瘤细胞转移。因此，乳酸合成减少限制了酸性肿瘤微环境的形成，如培养基pH值增加所示。此外，糖酵解基因的下调抑制了肿瘤细胞中线粒体OXPHOS向糖酵解的转化。增强的OXPHOS导致耗氧量增加。结果表明，敲除METTL5抑制了葡萄糖摄取和乳酸生成，增加了HCC细胞的pH值和耗氧量，而METTL5过表达则发挥了相反的作用（图2E-H）。接下来，作者测量了HCC细胞中的ECAR。METTL5敲除显著损害了HCC细胞系的糖酵解，而METTL5过表达则产生了相反的结果（图2I）。作者监测线粒体质量以评估代谢反应；METTL5敲除显著增加HCC细胞中线粒体DNA（mtDNA）含量，而METTL5过表达则发挥相反作用（图2J）。此外，MitoSceneTM系列绿色Ι和Mito Tracker TM系列红染结果显示，METTL5敲除增强了HCC细胞的线粒体功能，而METTL5过表达抑制了线粒体功能（图2K）。据报道，活性氧-氮（RONS）的产生以及缺氧和酸性肿瘤微环境触发线粒体功能障碍并通过Warburg效应增强线粒体自噬。线粒体自噬是一种降解受损线粒体的巨自噬形式，是线粒体对各种应激和代谢紊乱的适应性反应。作者进一步探讨了METTL5是否通过线粒体自噬调节mtDNA和线粒体功能。首先，作者分析了自噬体标志物的蛋白水平，如P62、Parkin、微管相关蛋白1轻链3β-1（LC3B-I）和LC3B-II。P62是一种线粒体自噬接头蛋白，其还原表明线粒体自噬。Western blotting结果显示，METTL5敲除下调了Parkin和LC3B-II的表达，但上调了P62的表达（图2L）。敲除METTL5后，TEM显示自噬体和线粒体减少。根据这些发现，METTL5增加了糖酵解，同时降低了HCC细胞中的线粒体OXPHOS，这与Warburg效应一致。
3. c-Myc在葡萄糖代谢的重编程中起着至关重要的作用
根据之前的一项研究，转录因子在调节糖酵解代谢中起着至关重要的作用。作者假设METTL5通过诱导转录因子的表达来促进糖酵解基因的转录。作者使用UCSC和JASPAR数据库来预测与糖酵解基因LDHA、ENO1、TPI1、SLC2A1和PKM2结合的转录因子。c-Myc、缺氧诱导因子1亚基α（HIF-1α）和MYC相关锌指蛋白（MAZ）可能是这些糖酵解基因的转录因子。结果表明，METTL5敲除降低了c-Myc蛋白的表达，但不影响c-Myc、HIF-1α或MAZmRNA的表达或HIF-1α和MAZ蛋白的表达，这与GSEA结果一致（图3A）。因此，作者怀疑c-Myc可能是将METTL5与糖酵解联系起来的铰链。c-Myc过表达减弱了METTL5敲除介导的糖酵解基因下调（图3B-C）、葡萄糖摄取和乳酸产生下调（图3D-E）、pH值和耗氧量上调（图3F-G）和ECAR的下调（图3H）。此外，c-Myc过表达减弱了METTL5敲除介导的线粒体呼吸和质量增加（图3I-K系列）。这些结果支持了METTL5调节c-Myc表达以调节糖酵解活性的假设。
图3 c-Myc在重编程葡萄糖代谢中起着至关重要的作用。
4. METTL5以m6A依赖性方式促进泛素特异性肽酶5（USP5）翻译
根据前期的结果，METTL5敲除显著降低了c-Myc蛋白的表达。此外，多核糖体分离分析表明，在METTL5-KO细胞中，c-Myc的翻译没有显著改变。根据先前的报道，多种泛素结合酶（泛素连接酶）和去泛素化酶通过蛋白酶体系统相互作用并调节c-Myc降解。作者使用翻译抑制剂CHX评估了c-Myc蛋白的稳定性，并证实METTL5延长了c-Myc蛋白的半衰期（图4A）。用蛋白酶体抑制剂MG132进行预处理可防止c-Myc稳定性的提高（图4B），表明METTL5敲除破坏了c-Myc的稳定性，导致其被蛋白酶体降解。随后的泛素化试验表明，METTL5过表达降低了c-Myc的泛素化和降解（图4C）。
作者进行了co-IP和MS鉴定了与HCC中c-Myc相互作用的潜在蛋白质，并研究了METTL5敲除如何促进c-Myc泛素化和降解（图4D）。作者无法鉴定出任何与c-Myc相互作用的METTL5肽。然而，有趣的是，作者发现含有7（FBW7）、F‐box蛋白32（FBXO32）、S期激酶相关蛋白2（SKP2）、USP7、USP37、USP28、USP36和含有32的三联基序（TRIM32）的USP5、F-box和WD重复结构域与c-Myc强烈相互作用。此外，METTL5敲除降低了USP5蛋白的表达，但没有显著改变其他去泛素化和泛素化相关蛋白的表达和翻译水平（图4E）。
METTL5通过甲基化18S rRNA来调节核糖体功能，METTL5-KO细胞的蛋白质比亲本对照细胞少约30%。作者使用METTL5-WT和METTL5-KO细胞的提取物进行多核糖体分离分析，以确定METTL5是否对USP5翻译有影响。结果表明，METTL5敲除对GAPDH mRNA谱没有影响，而USP5 mRNA从较重的多核糖体组分转移到较轻的组分（图4F）。这一结果表明，METTL5敲除抑制了USP5 mRNA的翻译。因此，作者研究了USP5翻译活性是否依赖于METTL5甲基化酶活性。敲除METTL5后，总RNA的m6A水平显著降低，如斑点印迹所示（图4G）。分离rRNA和mRNA后，LC/MS显示METTL5敲除显著降低了18S rRNA的m6A水平，但对mRNA的m6A水平没有影响（图4H）。此外，METTL5-KO细胞和METTL5-WT细胞之间c-Myc的m6A甲基化水平没有差异。然后，作者构建了一个没有酶活性的METTL5突变体。有趣的是，血凝素（HA）-METTL5-WT的过表达减弱了METTL5敲除对USP5的影响，但HA-METTL5-Mut的过表达并不能挽救USP5蛋白的表达（图4I）。因此，USP5的翻译直接依赖于METTL5 18S rRNA甲基转移酶活性。据报道，METTL3-METTL14复合物是一种众所周知的mRNA m6A甲基转移酶复合物，在体外也介导DNA m6A甲基化（m6DA）。然而，没有报告表明METTL5是否参与DNA甲基化。在METTL5-WT和METTL5-KO细胞中，作者检测到基因组DNA的m6DA区域的修饰。作者无法检测到METTL5敲除后的m6DA变化。使用双荧光素酶报告基因测定，作者随后确定METTL5对USP5启动子活性没有影响。结果表明，METTL5是一种纯RNA甲基化酶，对DNA甲基化没有调控作用。
图4 METTL5以m6A依赖性方式促进USP5翻译。
5. METTL5介导的c-Myc稳定需要USP5依赖性去泛素化
作者假设METTL5通过USP5稳定c-Myc。USP5是一种去泛素化酶，对蛋白质的稳定性和功能至关重要。去泛素化酶USP5的底物介导基本的生物学功能，包括细胞存活、增殖和死亡。然而，没有报道描述USP5如何去泛素化c-Myc。USP5敲低显著降低了HCC细胞系中的c-Myc蛋白水平。然后，作者研究了USP5是否通过去泛素化来稳定c-Myc。免疫荧光共定位和核质分离表明，c-Myc定位于核质中，USP5存在于细胞质和核质中（图5A‐B），表明c-Myc和USP5主要共定位在细胞核中。随后，使用内源性和外源性Co-IP测定显示了USP5和c-Myc之间的相互作用（图5C-D）。谷胱甘肽-S-转移酶（GST）下拉试验进一步证实，从细菌中纯化的GST-c-Myc（而非GST）下拉重组His-USP5（图5E）。重要的是，USP5过表达显著提高了c-Myc蛋白的稳定性，同时降低了c-Myc泛素化（图5F-G）。蛋白酶体抑制剂MG132预处理抑制了c-Myc水平的增加。USP5是一种∼120kDa蛋白，具有五个不同的结构域：两个ZnF结构域（1-168;169-289）、一个C盒结构域（290-624）、一个UBA1/UBA2结构域（625-749）和一个H盒结构域（750-835）。为了研究USP5的哪个结构域与c-Myc相互作用，将293T细胞与Flag-USP5和HA-c-Myc的不同结构域共转染，作者的结果表明只有U3和U4直接与c-Myc蛋白结合（图5H）。此外，USP5在K48键处抑制c-Myc多泛素化，但在其他键处不抑制c-Myc多泛素化（图5I）。当K48泛素化位点（K48R）发生突变时，USP5介导的c-Myc泛素化被消除（图5J）。这些结果表明，USP5特异性结合c-Myc并保护c-Myc免受多泛素化介导的降解。最后，在METTL5敲除存在下，USP5的过表达消除了METTL5对c-Myc的影响。这些数据表明，METTL5介导的c-Myc稳定需要USP5依赖性去泛素化。此外，作者使用免疫组化和蛋白质印迹法测定了HCC组织样本中METTL5、c-Myc和USP5蛋白的含量。根据相关性研究，METTL5蛋白水平与USP5和c-Myc蛋白水平呈正相关。与附近的正常肝组织相比，METTL5、USP5和c-Myc在HCC组织中表达强烈。最后，对TCGA-LIHC数据库和20对HCC组织的分析表明，USP5和c-Myc转录水平与糖酵解基因表达水平呈正相关。
图5 USP5是c-Myc的去泛素化酶。
6. METTL5促进HCC生长和转移
接下来，作者研究了METTL5敲低和过表达对HCC细胞增殖和迁移的影响，以进一步探讨METTL5在HCC中的功能。CCK-8、EdU和集落形成试验显示，METTL5敲除显著降低细胞增殖，METTL5过表达增加增殖（图6A-C）。Transwell和划痕愈合试验显示，METTL5敲除抑制细胞侵袭和迁移，METTL5过表达增加侵袭和迁移（图6D-E）。癌细胞必须经历上皮间充质转化（EMT）才能开始转移。因此，作者研究了METTL5是否对HCC细胞中的EMT有影响。qRT-PCR和Westernblotting结果显示，敲除METTL5下调间充质标志物（N-钙粘蛋白、纤连蛋白和波形蛋白）的表达，但上调E-钙粘蛋白的表达。相反，其过表达显示出相反的效果。这些结果表明METTL5促进了EMT。此外，METTL5缺失大大提高了细胞凋亡率，但对细胞周期没有影响（图6F）。构建HCC皮下异种移植模型、原位HCC小鼠模型、尾静脉注射肺转移模型和腹部转移模型，进一步研究METTL5在体内的作用。METTL5-KO组肿瘤生长和体重均显著低于METTL5-WT组（图6G网络）。免疫组化分析显示，METTL5-KO组Ki-67和糖酵解基因表达低于METTL5-WT组（图6H）。TUNEL标记显示，METTL5-KO组的细胞凋亡率明显高于METTL5-WT组（图6I）。在原位HCC小鼠模型中，METTL5-KO组的肿瘤生长明显慢，糖酵解基因表达比METTL5-WT组低得多（图6J）。肺转移肿瘤模型和腹部肿瘤转移模型显示，敲除METTL5显著降低了转移灶的平均生物发光强度和转移性结节数量（图6K-L）。基于这些结果，METTL5在体外和体内促进了HCC细胞的增殖和侵袭。
图6 METTL5促进HCC生长和转移。
7. METTL5的肿瘤促进功能取决于c-Myc介导的葡萄糖代谢重编程
由于葡萄糖代谢异常与HCC的进展有关，作者试图进一步确定c-Myc是否是METTL5介导的HCC进展的下游效应子。作者在METTL5-KO细胞系中过表达c-Myc来验证这一假设。一系列表型测试表明，在没有METTL5的情况下，c-Myc过表达降低了对Huh-7和HCC-LM3细胞增殖和侵袭的抑制（图7A-E）。作者进一步验证了c-Myc在裸鼠METTL5介导的HCC进展中的作用，发现METTL5敲除的作用确实被c-Myc过表达逆转（图7F-I）。这些结果表明，c-Myc对METTL5介导的HCC的体外发生和转移具有重要意义。
最后，作者在METTL5-KO细胞系中过表达USP5，以确定USP5的关键作用。一系列表型实验表明，在没有METTL5的情况下，USP5过表达减弱了对Huh-7和HCC-LM3细胞增殖和侵袭的抑制作用。此外，作者在体内验证了USP5参与METTL5介导的HCC进展，发现USP5过表达逆转了METTL5敲低对c-Myc表达和增殖的抑制作用（图7J-K）。这些数据表明，USP5对METTL5介导的HCC癌症促进功能至关重要。
图7 METTL5的肿瘤促进功能取决于c-Myc。
8. cAMP反应性元件结合蛋白1（CREB1）/P300促进METTL5转录
使用GeneCards、UCSC和JASPAR数据库进行计算机模拟研究，以确定与HCC中METTL5上调相关的潜在上游转录因子。CREB1、E74样ETS转录因子1（ELF1）和CCAAT增强子结合蛋白β（CEBPB）是METTL5的主要转录因子，由于CREB1敲低降低了METTL5mRNA和蛋白表达，因此选择CREB1进行进一步研究（图8A-B），但ELF1或CEBPB敲低没有。CREB1转录因子的DNA结合基序是从JASPAR获得的（图8C）。作者生成了一系列截短的METTL5启动子-荧光素酶构建体，以阐明CREB1介导的METTL5转录。荧光素酶报告基因检测结果显示，METTL5基因中碱基对1400至2100的启动子区域包含一个CREB1反应位点（图8C）。因此，作者通过在碱基1554和1565之间顺序突变预测的METTL5启动子序列来构建METTL5-WT和METTL5-Mut启动子荧光素酶报告载体。CREB1过表达增加了METTL5-WT载体的相对荧光素酶活性，但对METTL5-MUT载体的荧光素酶活性影响最小（图8D）。此外，ChIP研究表明METTL5启动子区域与CREB1相互作用（图8E）。如这些结果所示，CREB1通过与METTL5启动子区域结合来增强HCC中METTL5的表达。
此外，作者还研究了CREB1在HCC有氧糖酵解中的关键调控作用。对TCGA-LIHC数据库的分析显示，CREB1转录水平在HCC中显著上调（补充图S19A）。qRT-PCR和Westernblotting分析验证了HCC组织中CREB1mRNA和蛋白水平的上调。此外，TCGA-LIHC数据库的研究表明，CREB1转录水平与糖酵解基因表达水平呈正相关。HCC细胞中CREB1敲除在mRNA和蛋白质水平上显著抑制糖酵解基因LDHA，ENO1，TPI1，SLC2A1和PKM2的表达。TCGA数据库结果与中南医院80对HCC组织的相关性分析显示，METTL5表达与CREB1表达呈正相关。
据报道，E1A结合蛋白p300（p300）作为CREB1转录因子的共激活因子发挥作用，并直接与CREB1相互作用以增强其活性[30].荧光素酶报告基因试验表明，p300可能独立工作以刺激METTL5启动子上的METTL5转录和CREB1活性（图8H）。值得注意的是，当CREB1和p300共表达时，与单独使用基础启动子相比，METTL5转录提高了30倍。这个量明显超过累加量，这意味着CREB1和P300具有功能协同作用。由于METTL5启动子结合位点的突变，这种效应消失了。此外，ChIP分析结果显示p300不能与METTL5启动子区域结合。总的来说，这些结果表明p300在METTL5启动子上作为CREB1共激活因子发挥作用。
图8 CREB1促进METTL5转录。
9.METTL5敲除抑制PDX模型中的肝肿瘤生长
由于PDX与患者的实际临床标本惊人相似，PDX正迅速成为临床药物研究的黄金标准。将从第二代PDX模型中解剖的肝癌组织植入NCG小鼠体内，以评估METTL5敲除是否对PDX模型产生类似的影响（图9A-B）。腺病毒介导的敲除METTL5具有良好的抗肿瘤作用（图9C-D）。通过蛋白质印迹法证实了METTL5敲除效率（图9E）。
图9 METTL5-KO在HCCPDX模型中的显著抗肿瘤作用。
在治疗期间，所有小鼠的体重保持相似（图9F）。AAV-METTL5-KO组Ki-67表达较低，细胞凋亡率较高（图9G）。METTL5敲除显著延长了生存时间（图9H）。当结合其他结果时，PDX模型中METTL5敲除的显著肿瘤抑制作用为METTL5敲除在临床开发中的巨大潜力提供了强有力的证据。根据集体数据，作者得出结论，METTL5被CREB1/P300激活，通过促进USP5翻译减少c-Myc泛素化，从而导致HCC恶性进展（图9I）。
结语
作者的研究结果为METTL5过表达对HCC的细胞内在影响提供了新的视角，这意味着，除了在RNA甲基化中众所周知的作用外，METTL5还通过许多促癌USP5-c-Myc信号级联调节HCC细胞的增殖和迁移。作者的研究结果为肿瘤代谢相关靶点提供了新的见解，并为未来开发新的HCC治疗方法提供了思路。
实验方法
细胞培养，免疫荧光，免疫组化染色，蛋白质印迹分析，免疫共沉淀（co-IP），泛素化分析，质粒、siRNA、慢病毒构建和细胞转染，蛋白表达和纯化，CCK-8测定，菌落形成测定，划痕伤口愈合运动试验，transwell侵袭试验，细胞凋亡和细胞周期分析，TUNEL染色，小鼠和体内实验，RNA测序（RNA-seq），线粒体形态分析，细胞外酸化率（ECAR）测量，非靶向代谢组学，液相色谱-质谱（LC/MS），双荧光素酶测定，染色质免疫沉淀（ChIP）测定，多核糖体分析，透射电子显微镜（TEM）
参考文献
Xia P, Zhang H, Lu H, Xu K, Jiang X, Jiang Y, Gongye X, Chen Z, Liu J, Chen X, Ma W, Zhang Z, Yuan Y, METTL5 stabilizes c-Myc by facilitating USP5 translation to reprogram glucose metabolism and promote hepatocellular carcinoma progression. Cancer Commun (Lond). 2023; 43(3): 338-364.