16S测序联合空间转录组确定肠道细菌Akk调控肿瘤内微生物组和代谢结构
尽管肠道微生物群与癌症存在关联，但关于肠道微生物与肿瘤内微生物组之间的相互作用知之甚少。本研究的目标是确定肠道Akkermansia muciniphila（Akk）是否参与调控肿瘤内微生物组和代谢结构，从而在肺癌上产生抗癌效果。作者使用Lewis肺癌小鼠模型评估了肠道内源或灌胃外源阿克对肿瘤发生的影响。采集了粪便、血液和肿瘤组织样本进行16S rDNA测序。然后，进行了空间解析代谢组学分析，直接发现了原位癌代谢产物，并表征了Akk调控的整体代谢特征，随后进行了肿瘤内细菌与代谢网络的相关分析。结果显示，无论是内源还是灌胃外源的Akk都显著抑制了肿瘤发生。此外，与对照组相比，在灌胃Akk的小鼠中通过16S rDNA测序检测到了血液循环或肿瘤组织中阿克的增加。有趣的是，灌胃的Akk可能迁移到肿瘤组织中并影响肿瘤内微生物组的组成。空间解析代谢组学分析揭示了肠道来源的Akk能够调节肿瘤的代谢途径，从代谢产物到酶。最后，研究确定了肠道Akk调控的肿瘤内细菌与代谢网络之间的显著相关性。综合而言，肠道来源的Akk可能迁移到血液循环，然后定植到肺癌组织中，通过影响肿瘤共生微生物组和重编程肿瘤代谢，有助于抑制肿瘤发生，尽管还需要更多的研究。本文于2023年2月发表在《Gut Microbes》IF:12.2期刊。
技术路线：
主要研究结果：
1、肠道Akk抑制Lewis肺癌小鼠的肿瘤发生
为确定内源性肠道微生物群与肺癌发生的关系，使用肺癌小鼠模型，总共使用108只小鼠。其中，92只小鼠在皮下注射后1周出现可观察的肿瘤结节（直径为4-5毫米）（第1组）。另外的16只小鼠（第2组）被进行监测。在这16只小鼠中，有6只在第2周出现可观察的肿瘤结节（直径为4-5毫米）（第2a组），其余的10只即使在皮下注射后4周也没有显示任何肿瘤生长（第2b组）（图1a）。
对group 1和group 2进行16S测序，使用beta多样性分析生成了加权UniFrac PCoA，展示了第1组和第2组之间的聚类关系（图1b）。LEfSe分析从门到属的所有分类水平共鉴定出32个具有差异性的分类群。在门的水平上，Verrucomicrobiales、Bifidobacteriaceae和Actinobacteria在第2组中增加，而Bacteroidaceae、Flavobacteriaceae、Helicobacteraceae和Enterobacterales在第1组中富集（图1c）。此外，Venn图在物种水平上检测到第1组和第2组分别有326和319个OTUs，其中两组共有252个OTUs（图1d）。在属的水平上，Akk和Bifidobacterium（Bifidobacterium pseudolongum）的丰度在第2组的小鼠中显著升高，尤其是在第2b组的小鼠中（图1e）。
因此，进一步确定外源性肠道Akk对三组小鼠中肿瘤增殖的影响，包括对照组（con.）、Akk组和Akk/Bio组合组（小鼠通过灌胃同时摄入阿克和Bifidobacterium pseudolongum）。Akk或双歧杆菌（2 × 108 CFU，0.15–0.2毫升PBS）每2天灌胃一次，从在Lewis癌细胞皮下注射前的第2周开始。对照小鼠则用相同体积的PBS进行灌胃，并在牺牲前一直监测小鼠。发现，灌胃Akk显著抑制了肿瘤的增殖，而Akk组和Akk/Bio组之间没有显著差异（图1f）。然后，在后续实验中专注于Akk。
图1 肺癌小鼠模型肠道微生物群落及多样性分析
2、使用AFADESI-MSI方法进行空间解析代谢组学的极性代谢物分析
图2a是本研究的总体设计示意图。通过基于MSI的原位代谢组学结合代谢途径分析，在肺癌组织中确定了潜在的Akk介导的与肿瘤相关的代谢物和代谢酶。对于这项分析，根据不同的解剖癌症亚区域，包括非坏死区域、旁坏死区域和坏死区域，将每个肿瘤切片分为三种组织学类型（图2b，c）。
首先对小鼠肿瘤的连续切片进行了AFADESI-MSI分析。簇分析和肿瘤切片的H&E染色显示了肿瘤组织的清晰亚结构。然后，对Lewis肺癌组织中的特定区域分布进行了极性代谢物分析。图2b显示了AFADESI-MSI图像的簇，展示了不同解剖癌症亚区域中代谢物浓度的变化。H&E染色显示了癌症切片中不同解剖癌症亚区域的清晰亚结构（图2c）。
接下来，通过ESI探针逐像素扫描肿瘤组织切片，并通过高分辨质谱分析器在正离子和负离子模式下分析解吸附的离子。引用29中精确提取和绘制了乳酸代谢（图2d）和谷氨酸代谢（图2e）的特定质谱图。这些图像显示了肿瘤亚区域中特定的异质代谢分布，与癌症的功能和结构复杂性高度一致（图片为代表性样本）。
图2 肺癌小鼠模型肿瘤切片的极性代谢物谱
3、Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：描绘区域特定的代谢网络
然后，显微镜图像与匹配的质谱图像集成，形成具有空间分辨率的叠加图像。基于从肿瘤亚区域提取微区域代谢剖面的物理结构，重建了一个代谢网络。显微镜-MSI叠加图像显示出每个三个肿瘤亚区域的特定质谱被精确提取（图3a-3b），并呈现为代谢物剖析。
图3c–e总结了非坏死区域（图3c）、旁坏死区域（图3d）和坏死区域（图3e）中富集的代谢途径。根据代谢物剖析，通过气泡图（图3c–e）显示了富集的途径。这些结果显示，在肿瘤组织中，诸如嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、中心碳代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、嘧啶代谢以及脂肪酸生物合成等富集的代谢途径受到Akk的灌胃显著影响。
基于KEGG的代谢网络使作者能够在系统水平深入了解肺癌的代谢活动。在本研究中，非坏死肿瘤组织中微区域代谢信息及其互动网络被分为26个KEGG途径。对上下文途径的进一步分析表明，谷氨酰胺代谢、嘌呤和嘧啶代谢、糖酵解代谢和谷胱甘肽代谢等多种代谢途径之间存在密切的调控关系（图3f）。
图3 区域特异性代谢网络的映射
4、Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：Akk调节糖酵解代谢
在这项研究中，根据它们的物理结构，显微图像和代谢产物的MSI图像进行叠加，以提取不同解剖癌症亚区域中乳酸的微区域代谢剖面（图4a-e）。显然，肺癌组织中的糖酵解代谢失调：乳酸的离子强度在整个肿瘤区域中高度表达。灌胃Akk显著降低了不同解剖癌症亚区域中乳酸的水平（图4c）。与代谢物剖析一致，免疫组织化学（IHC）显示，作为调控糖酵解代谢的酶的LDHA在癌症区域中高度表达，而在灌胃Akk的组中显著减少（图4f）。
图4 原位可视化糖酵解代谢途径中关键代谢物和代谢酶
5、Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：Akk通过对关键代谢产物的原位可视化调控谷氨酰胺代谢
质谱图像由连续的像素组成，因此可以反映肿瘤中代谢物的相对含量，尤其是来自不同肿瘤亚区域的区域特异性差异代谢产物。研究表明，癌细胞对谷氨酰胺（Gln）有很强的依赖性。谷氨酰胺的分解代谢是通过谷氨酸酶（GLS）介导的，通过水解谷氨酰胺生成谷氨酸。MSI分析显示，Lewis肺癌组织中Gln代谢明显失调。如图5a所示，作为Gln水解产物的谷氨酸、天冬氨酸、琥珀酸和苹果酸在Lewis肺癌组织中显著增加，然而与对照组相比，在Akk组中显著下调。
此外，基于离子强度的MSI提供了一种评估在不同组织区域中强度变化的方法，这可能反映了GLS介导的原位谷氨酸（谷氨酸）水解速率。图5b显示了不同癌症亚区域中Glu、天冬氨酸、琥珀酸和苹果酸的空间表达。与被改变的代谢物直接相关的代谢途径中的代谢酶被选择为潜在的与肿瘤相关的代谢酶。GLS催化Gln分解的主要途径中的第一反应。免疫组织化学染色显示，GLS在癌症组织中显著上调，而在Akk组中显著下调（图5c），与基于离子强度的Glu MS图像的结果一致。
图5 谷氨酰胺代谢途径中关键代谢物和代谢酶的原位可视化
6、Akk灌胃对肿瘤代谢的影响：Akk调节嘌呤和嘧啶代谢
核苷酸的合成可以通过多种代谢途径进行调控，这些核苷酸对于维持癌细胞的快速增殖是必不可少的营养物质。其中一种机制是通过增强糖酵解代谢或谷氨酰胺代谢，产生更多核苷酸合成所需的分子前体。MSI分析表明，在对照组的Lewis肺癌中，核苷酸生物合成，如AMP、ADP、GMP和UMP，在肿瘤组织中显著表达（图6a），与此同时，在Akk组的癌症组织中，核苷酸生物合成显著下调（图6b）。
图6 通过关键代谢物的原位可视化和定量分析确定，灌胃Akk下调核苷酸生物合成代谢
7、灌胃Akk对肠道微生物的影响
考虑到灌胃Akk对肠道微生物的影响，作者试图确定对照组和Akk灌胃组（n = 8）之间的肠道微生物组成和多样性。通过16S rDNA测序分析肠道微生物的α多样性，结果显示在对照组（CFA）和Akk灌胃组（AFA）之间的物种丰富度指数（Chao）（p = .8068）、Shannon指数（p = .9188）和Simpson指数（p = .3884）之间没有显著差异（图7a-c）。通过β多样性，加权UniFrac主坐标分析（PCoA）显示了对照组和Akk小鼠之间的聚类关系（图7d）。此外，如Venn图所示，在对照组和Akk灌胃组中分别检测到2350和2259个OTUs，其中有1988个OTUs同时存在于两组中（图7e）。为确定与Akk相关的特定微生物群，通过LEfSe分析分析了两组小鼠的肠道微生物组成。在属的水平上，Akk的丰度在阿克灌胃小鼠的肠道微生物中升高，而Enterobacterales、螺旋菌属和拟杆菌门的丰度在对照小鼠的肠道微生物中增加（图7f）。
图7 灌胃Akk对小鼠肠道菌群的影响
8、灌胃Akk对肿瘤微生物群的影响
接下来，作者试图确定灌胃Akk对肿瘤内微生物群的影响。通过16S rDNA测序分析了肿瘤微生物群的α多样性。对照组（CT组）和Akk灌胃小鼠（AT组）之间的物种丰富度Chao指数（p = .2575）、Shannon指数（p = .3382）或Simpson指数（p = .2488）没有差异（图8a）。β多样性的PCoA分析显示了对照组和阿克灌胃小鼠之间的聚类（图8b）。此外，如Venn图所示，在对照组和阿克灌胃小鼠中分别检测到853和424个OTUs，其中有278个OTUs同时存在于两组中（图8c）。
LEfSe分析显示，在门的水平上，Bradyrhizobium、Vibrionimonas Verrucomicrobiales和Lactobacilius的丰度在Akk灌胃组的肿瘤中增加，而Gammaproteobacteria、Sphingomonadales和Acidobacteriae的丰度在对照组中富集（图8d-e）。如预期的那样，与对照组相比，Akk在灌胃Akk的肺癌小鼠的肿瘤组织中的丰度升高（AT组对比CT组）（图8d-8f）。
图8 灌胃Akk对肺癌小鼠瘤内微生物组的影响
9、肠道微生物与肿瘤微生物的相互作用：肠道细菌可能通过全身循环迁移到肺癌组织
肠道Akk与肿瘤内微生物之间的正向关系表明肠道细菌可能会迁移到癌组织中。因此，作者想知道肠道Akk是否通过全身血液循环迁移到肿瘤组织中。在SPF条件下，C57BL/6小鼠被分为两组，对照组（CB）和灌胃Akk和双歧杆菌的细菌组（AB）。在细菌灌胃后的2小时和6小时收集血样进行16S rDNA测序分析。为了确定与Akk和双歧杆菌灌胃相关的特定微生物群，使用LEfSE方法分析了血样本中微生物的组成。在门的水平上，细菌灌胃小鼠的血样本中Verrucomicrobia（Akk属于Verrucomicrobia）和双歧杆菌科的丰度增加（图9a，b）。在属的水平上，阿克和双歧杆菌在细菌灌胃后的2小时血液中升高，而在细菌灌胃后的6小时血液中无法明显检测到阿克或双歧杆菌（图9c）。
图9 血液循环中肠道细菌的检测
10、不同肿瘤微生物群与鉴别代谢物之间的关系
通过斯皮尔曼相关性分析评估了肿瘤组织中差异菌属与代谢物之间的关联。图 10a 显示了基于 LEfSe 分类学分析的最高差异种属与糖酵解代谢、Gln 代谢、嘌呤和嘧啶代谢等途径中最高鉴别代谢物的相关性。
图10 差异细菌与差异代谢物的关联分析
实验方法：
动物建模和药物处理，细胞培养，Akkermansia muciniphila （Akk）培养，16S rDNA测序，免疫组化（IHC），细菌灌胃定植，HE染色，空间代谢组及其分析
参考文献:
Zhu Z, Cai J, Hou W, Xu K, Wu X, Song Y, Bai C, Mo YY, Zhang Z. Microbiome and spatially resolved metabolomics analysis reveal the anticancer role of gut Akkermansia muciniphila by crosstalk with intratumoral microbiota and reprogramming tumoral metabolism in mice. Gut Microbes. 2023 Jan-Dec;15(1):2166700. doi: 10.1080/19490976.2023.2166700. PMID: 36740846; PMCID: PMC9904296.