IGF2BP3通过m6A RNA甲基化调节喉癌中TMA7介导的自噬和顺铂耐药
翻译体系相关的7同源物（TMA7）与增殖相关疾病密切相关。然而，TMA7在喉鳞状细胞癌（LSCC）中的作用和调控机制尚不清楚。本研究旨在探讨TMA7在喉癌发生发展中的作用，并探讨其作用机制。TMA7在喉鳞状细胞癌组织中表达上调，并与预后不良有关。TMA7下调后，自噬水平增加，抑制了LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。M6A甲基化阅读器IGF2BP3增强了TMA7的稳定性，降低了自噬水平。TMA7与UBA2直接相互作用。此外，IGF2BP3调节的TMA7-UBA2-PI3K通路的激活是TMA7抑制自噬、促进喉癌进展的主要机制。目前的研究表明，IGF2BP3介导的TMA7 m6A修饰通过UBA2-PI3K途径促进LSCC的进展和顺铂耐药，为LSCC自噬相关机制、潜在的生物标志物和治疗靶点提供了新的见解。本文于2023年2月发表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF=9.2
主要技术路线：
1、喉癌组织中TMA7癌基因表达上调
为了研究该基因的表达，我们选择了5对喉癌和癌旁组织进行蛋白质组学和转录组学联合分析。我们选择了OmicStudio工具来分析数据。结果如图1a-e所示。在log2FoldChange>1或log2FoldChange<-1（p<0.05）的转录分析中，剔除极端数据后，选取有代表性的基因进行聚类分析，其中54个基因与癌旁组织相比显著上调，11个基因显著下调（图1A）。在蛋白质组学分析结果中，在p<0.05处，2486个蛋白质表现出显著差异。在相同条件下，剔除极端数据后，选择具有代表性的蛋白质进行聚类分析，与癌旁组织相比，15个蛋白质显著上调，15个蛋白质显著下调（图1B）。
转录组分析表明，6828个基因在患者样本中与邻近组织中存在差异表达。在蛋白质组学数据中，共有6187个蛋白质得到了差异表达。在两组数据中总共有2131个差异表达的基因（图1C）。对这两组数据的相关性分析表明，在转录和蛋白质组数据中存在差异表达的基因，如图1D所示。蓝点代表了两个具有相同组学表达趋势的基因。火山图也是使用OmicStudio工具进行的（图1E）。此外，我们评估了在特定筛选条件下喉癌组织中上调基因的意义、组织中的蛋白质含量以及差异表达倍数，并鉴定了上调表达的基因。
其中，TMA7在RNA和蛋白质水平上均有上调。因此，我们选择TMA7作为目的基因。统计分析表明，喉癌组织中TMA7的表达水平在蛋白质水平和RNA水平均高于癌旁组织。根据喉癌组织中TMA7的表达情况分析其临床病理特征（表1）。如表1所示，喉癌TMA7高表达患者的临床分期（***p<0.001）和T分期（**p<0.01）均较高。此外，TMA7升高的患者有淋巴结转移（***p<0.001）和频繁复发（**p<0.01）。然而，TMA7的表达与年龄、性别和原发部位无关。此外，Kaplan-Meier生存曲线显示TMA7升高与预后不良相关（图1F-G）。因此，TMA7的IHC是在喉癌和癌旁组织中进行的，如图1H所示。
图1 TMA7作为癌基因在喉癌组织中表达上调
2、TMA7影响喉鳞状细胞癌的增殖、侵袭、迁移和凋亡
为了阐明TMA7在LSCC细胞中的生物学功能，我们用慢病毒TU177、AMC - HN8和TU212的shRNA转染LSCC细胞系来KD TMA7的表达（TMA7-KD）。RT-qPCR和Western blot证实TMA7被成功敲除（图2A, B）。集落形成和EdU检测显示TMA7-KD抑制细胞增殖（图2C, D）。Transwell分析显示，TMA7 KD降低了LSCC细胞的侵袭性（图2e）。随后，通过伤口愈合试验进行评估了LSCC细胞的迁移能力降低，随后TMA7水平下降（图2F）。在LSCC细胞TMA7-KD后，细胞的凋亡率增加（图2G）。综上所述，这些结果表明TMA7-KD减弱了LSCC细胞的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力，增加了细胞的凋亡率。
图2 TMA7影响喉鳞状细胞癌的增殖、侵袭、迁移和凋亡
3、TMA7与喉癌细胞自噬相关
为了研究TMA7与下游分子之间的调控相关性，我们对三个LSCC细胞系及其相应的TMA7 KD细胞系进行了RNA-SEQ检测。相关下游RNA分子的表达水平发生了变化。我们还发现，在FC≥1.5且p<0.05的截止点TMA7-KD上调了945个基因，下调了2521个基因。接下来，我们筛选出了泛素样修饰物激活酶2（UBA2），它通过添加小蛋白SUMO（参见SUMO 1；MIM 601912）或类泛素化来调节蛋白质结构和细胞内定位，从而实现蛋白质的翻译后修饰。我们发现它的mRNA水平降低，经过GO分析，它与蛋白质结合有关。数据库分析表明，它在UniProt预测的细胞质中表达。UBA2-KD促进肾透明细胞癌细胞的凋亡。本研究讨论了与细胞凋亡和自噬相关的表型，因为细胞凋亡和自噬与癌症有关。因此，我们推测UBA2除了与细胞凋亡有关外，是否还与自噬有关，这在以前还没有描述过。本研究探讨了UBA2与自噬表型相关途径的调控关系，并选择UBA2作为TMA7的下游基因进行进一步研究。
为了研究喉鳞状细胞癌TMA7-OE细胞生物学功能的变化，将TMA7-OE慢病毒导入LSCC细胞。RT-qPCR结果显示，TMA7-OE慢病毒感染LSCC细胞后，TMA7的表达相应增加（图3A）。TMA7-OE慢病毒从Genecem（MD，美国）获得。此外，我们进行了Western印迹以验证LSCC细胞TMA7的OE和KD（图3B）。结果表明，TMA7在LSCC细胞中成功地过表达或沉默（图2B，图8A），蛋白质含量相应地增加和减少。为了研究LSCC细胞中的自噬和TMA7，我们检测了与自噬相关的蛋白：P62、LC3B-I和LC3B-II。TMA7-OE后，细胞自噬减弱，p62表达增加，LC3B-II/I比值降低。TMA7-KD提供了相互矛盾的结果（图3B）。
用黄色自噬小体（mCherry和GFP）和红色自噬溶体（MCherry）标记的串联荧光报告基因（mCherryGFP-LC3）直接监测自噬通量。因此，黄点和红点分别表示自噬小体和自噬溶体。用腺病毒（mCherry-GFP-LC3、韩恒、中国）感染用TMA7OE或KD感染的LSCC和对照细胞。共聚焦显微镜显示，单个细胞的黄点和红点的比例不变，但点数增加。分析表明，自噬-溶酶体代谢没有改变，总体自噬水平增加。TMA7-KD后自噬增加，TMA7-OE后自噬减少（图3C）。UBA2的表达在TMA7-KD后减少，TMA7-OE后增加（图3B）。因此，我们推测UBA2可能是TMA7的下游分子，并被选中进行进一步的研究。
图3 TMA7与喉鳞状细胞癌自噬相关
4、IGF2BP3在喉癌细胞中的癌基因功能
对来自多个数据集的差异表达基因的分析表明，除了TMA7上调外，IGF2BP3在喉癌组织中也上调。在LSCC细胞中，IGF2BP3-KD或-OE后，IGF2BP3水平成功改变（图4A-B）。免疫印迹显示IGF2BP3-KD后IGF2BP3、TMA7和UBA2表达降低，而IGF2BP3-OE后IGF2BP3、TMA7和UBA2表达增加。为了研究IGF2BP3与LSCC细胞自噬的相关性，我们检测了自噬相关蛋白P62和LC3B。IGF2BP3-OE后，自噬减弱，p62增加，Lc3B-II/I比值降低。相反，IGF2BP3的下调导致了相反的结果（图4C）。
接下来，我们研究了IGF2BP3对LSCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。克隆形成、EDU、伤口愈合和Transwell分析表明IGF2BP3-KD抑制LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭（图4D-f，4h），而IGF2BP3-OE促进相反的结果。IGF2BP3-KD后LSCC细胞的凋亡增加，IGF2BP3-OE后LSCC细胞的凋亡减少（图4G）。IGF2BP3-KD后自噬水平增强，IGF2BP3-OE后自噬水平减弱（图4I）。
IGF2BP3促进LSCC细胞迁移、增殖和侵袭，减少细胞凋亡和自噬，调节TMA7和UBA2的表达水平。
图4 IGF2BP3在喉癌细胞中起癌基因的作用
5、IGF2BP3通过m6A甲基化调控TMA7
m6A在mRNA调控中起重要作用。TMA7 mRNA的3’-未翻译（UTR）序列包含一个典型的m6A修饰基序，该基序由生物信息学分析（图5A）管理。为了预测m6A修饰的可能位点，我们对MEME进行了基序预测，得到了预测的m6A修饰位点序列RRACH（D=A、G或U；R=A或G；H=A、U或C）。m6A甲基化修饰发生在基序的A碱基上（图5B）。Western印迹分析表明，在TU212细胞中的TMA7正义RNA探针下拉样本中存在IGF2BP3（图5C）。为了证明IGF2BP3与TMA7之间的相互作用，我们进行了RIP实验，结果表明IGF2BP3可能与TMA7结合（图5D）。接下来，我们在TU212中进行了MERIP，并在TMA7的3’-UTR区域发现了一个m6A修饰位点。因此，我们选择了上述序列并进行了下一步的验证。MERIP后的RT-qPCR分析（m6A RIP）进一步证实了m6A修饰的TMA7 mRNA（图5E）。与促进蛋白质翻译的潜在作用相一致，减少TMA7 mRNA的m6A修饰降低了TMA7蛋白的表达和新生TMA7蛋白的合成。（图4C）。随后，我们得出结论：IGF2BP3直接与TMA7的mRNA分子结合。IGF2BP3 OE或KD后，用Actinomycin D检测TMA7 mRNA在LSCC细胞上的稳定性。如前所述，提取总RNA用于RT-qPCR分析。计算指定时间点的mRNA表达，并根据GAPDH的表达进行标准化。因此，我们得出结论，IGF2BP3的消除可以缩短TMA7 mRNA的半衰期。IGF2BP3-OE延长了TMA7 mRNA的半衰期（图5F，g）。
图5 IGF2BP3通过m6A甲基化识别和结合TMA7
6、UBA2在喉癌细胞中的癌基因功能
在用RNA-seq（图3）分析了差异表达基因后，我们选择UBA2作为TMA7的下游分子，用于TMA7-KD之后的下一步研究。
据报道，UBA2在癌症中起主要作用，但它在喉癌中的作用尚不清楚。目前的数据表明，LSCC细胞中的UBA2-OE或UBA2-KD成功地改变了UBA2的表达（图6A-C）。为了阐明UBA2和自噬在LSCC细胞中的作用，我们对自噬相关蛋白P62和LC3B进行了研究。UBA2的OE减少了自噬，增加了p62，降低了LC3B-II/I比值。UBA2的破坏导致LC3B-II/I升高，p62降低（图6C）。
接下来，我们研究了UBA2对LSCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。克隆形成、EDU、伤口愈合和Transwell分析表明，UBA2-KD抑制LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，而UBA2-OE促进这种差异（图6D-G）。UBA2-KD后细胞凋亡率增加，UBA2-OE后细胞凋亡率降低（图6H）。此外，当UBA2缺失时，自噬增加，而当UBA2过度表达时，自噬减弱（图6I）。先前的一项研究证明，TMA7的水平与UBA2（图3B）有关；因此，我们进行了co-IP实验。结果表明，这两个分子直接相互作用（图6J），表明两个分子可能相互结合。结果表明，UBA2在喉鳞状细胞癌中起癌基因作用。在UBA2和TMA7之间建立了结合关系。
图6 UBA2在喉癌细胞中的癌基因功能
7、TMA7通过UBA2和PI3K/mTOR途径影响LSCC自噬
在TMA7-KD后，我们用RNA-seq富集PI3K-mTOR通路，发现PI3K-mTOR通路与TMA7的变化有关。因此，我们进一步研究了TMA7对PI3K-mTOR信号通路的影响。Western印迹分析表明，TMA7-KD减少，而TMA7-OE增加了PI3K和mTOR的磷酸化水平（图7A）。推测TMA7可以激活PI3K-mTOR信号通路。自噬通量分析表明，UBA2-OE减弱了TMA7-KD引起的自噬增加，而UBA2-KD增强了TMA7-OE引起的自噬减少（图7C）。
为了评估PI3K-mTOR信号通路在TMA7介导的自噬抑制中的重要性，我们用雷帕霉素处理TMA7-OE LSCC细胞。Western印迹和自噬通量分析表明，当3-MA处理TMA7-KD LSCC细胞时，抑制PI3K磷酸化可以重新激活被TMA7-OE抑制的自噬，而PI3K磷酸化的激活再一次抑制了由TMA7-KD激活的自噬（图7B，C）。此外，UBA2-OE还可挽救TMA7-KD引起的细胞增殖、侵袭和迁移的减少。此外，UBA2-KD挽救了TMA7-OE引起的细胞增殖、侵袭和迁移（图7D，7F-H）。UBA2-OE挽救了TMA7-KD引起的细胞凋亡增加，而UBA2-KD拯救了TMA7-OE引起的细胞凋亡减少（图7E）。因此，我们推测TMA7与UBA2相互作用，并通过PI3K/mTOR信号通路调节喉癌自噬水平。
图7 TMA7通过UBA2和PI3K/mTOR途径影响LSCC自噬
8、IGF2BP3通过TMA7调节LSCC自噬和UBA2表达
为了验证TMA7在IGF2BP3介导的抑制自噬中的重要性，用TMA7-KD感染IGF2BP3-OE LSCC细胞，用TMA7-OE慢病毒处理IGF2BP3-KD LSCC细胞。Western印迹显示，TMA7-KD可抑制IGF2BP3-OE诱导的UBA2上调和自噬抑制。而IGF2BP3-KD对UBA2的下调和自噬的激活则被TMA7-OE拯救（图8A）。在此，TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD诱导的细胞增殖、侵袭和迁移的减少。相反，TMA7-KD挽救了IGF2BP3-OE诱导的细胞增殖、侵袭和迁移的增加（图8B-E）。
结果表明，TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD引起的细胞凋亡增加。此外，TMA7-KD还挽救了IGF2BP3-OE引起的细胞凋亡的减少（图 8F）。自噬通量表明TMA7-OE减弱了IGF2BP3-KD诱导的自噬增加。相反，TMA7-KD增强了IGF2BP3-OE诱导的自噬的减少（图8G）。
因此，我们得出IGF2BP3和TMA7之间的相互作用，且IGF2BP3通过TMA7调节LSCC中UBA2的表达和自噬。
图8 IGF2BP3通过TMA7调节LSCC自噬和UBA2表达
9、TMA7影响LSCC细胞自噬诱导的顺铂耐药
为了检查TMA7是否调节喉癌对顺铂的化疗敏感性，我们构建了顺铂耐药的AMC-HN-8/DDP和TU212/DDP细胞。结果显示，TMA7增加可促进细胞活力并诱导顺铂处理细胞的化疗耐药性，而RAPA则使细胞对顺铂处理敏感。雷帕霉素可能会改变TMA7对LSCC细胞耐药性的影响（图9A-D）。RAPA降低了IC50，而TMA7-OE增加了IC50（图9E）。
此外，我们替换了自噬抑制剂雷帕霉素，雷帕霉素可以抑制自噬并检测自噬相关蛋白。Western blotting显示TMA7-OE增加了p62并降低了LC3B-II/I比率，而雷帕霉素触发了顺铂耐药细胞的自噬（图9F）。
接下来，我们检查了TMA7对顺铂耐药细胞中PI3K-mTOR信号传导的影响。Western blot表明TMA7-OE增加，而雷帕霉素降低mTOR磷酸化水平。此外，TMA7-OE降低了BAX、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的水平，而雷帕霉素增加了这些蛋白的水平，表明由于顺铂耐药细胞的凋亡水平较低（图9G），TMA7-OE激活顺铂耐药细胞中的PI3K-mTOR通路。
自噬通量表明雷帕霉素减弱了TMA7-OE诱导的自噬减少（图9H）。在裸鼠体内，用TMA7-KD转染的LSCC细胞（n=5）治疗，另一组用TMA7-KD和UBA2-OE转染的TU212稳定细胞治疗（n=5），第三组注射TU212细胞。所有裸鼠饲养34天。异种移植数据显示，低水平的TMA7显著抑制异种移植瘤的生长，而UBA2-OE增强喉癌的致瘤性（图9I，K，L）。
与未处理的LSCC细胞相比，TMA7-KD细胞中的自噬小体由线粒体结构组成，表明TMA7-KD激活了线粒体自噬并触发了随后的自噬（图9J）。
图9 TMA7对自噬诱导LSCC细胞顺铂耐药的影响
综上所述，目前的研究表明，TMA7在喉鳞状细胞癌中升高，与预后不良有关。TMA7是一种癌基因，调节喉癌细胞的增殖、侵袭、凋亡、自噬和化疗敏感性。TMA7通过UBA2调节PI3K/mTOR通路，而IGF2BP3以m6A依赖的方式调节PI3K/mTOR通路。因此，这项研究可能为喉癌提供潜在的分子标记和治疗靶点（图9M）。
实验方法
WB、转录组学和蛋白质组学多组学分析、集落形成试验、Transwell侵袭试验
参考文献：
Yang L, Yan B, Qu L, Ren J, Li Q, Wang J, et al. IGF2BP3 Regulates TMA7-mediated Autophagy and Cisplatin Resistance in Laryngeal Cancer via m6A RNA Methylation. Int J Biol Sci. 2023;19(5):1382-400. Epub 2023/04/15. doi: 10.7150/ijbs.80921. PubMed PMID: 37056932; PubMed Central PMCID: PMCPMC10086756.