翻译体系相关的7同源物(TMA7)与增殖相关疾病密切相关。然而,TMA7在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的作用和调控机制尚不清楚。本研究旨在探讨TMA7在喉癌发生发展中的作用,并探讨其作用机制。TMA7在喉鳞状细胞癌组织中表达上调,并与预后不良有关。TMA7下调后,自噬水平增加,抑制了LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。M6A甲基化阅读器IGF2BP3增强了TMA7的稳定性,降低了自噬水平。TMA7与UBA2直接相互作用。此外,IGF2BP3调节的TMA7-UBA2-PI3K通路的激活是TMA7抑制自噬、促进喉癌进展的主要机制。目前的研究表明,IGF2BP3介导的TMA7 m6A修饰通过UBA2-PI3K途径促进LSCC的进展和顺铂耐药,为LSCC自噬相关机制、潜在的生物标志物和治疗靶点提供了新的见解。本文于2023年2月发表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上,IF=9.2
主要技术路线:
1、喉癌组织中TMA7癌基因表达上调
为了研究该基因的表达,我们选择了5对喉癌和癌旁组织进行蛋白质组学和转录组学联合分析。我们选择了OmicStudio工具来分析数据。结果如图1a-e所示。在log2FoldChange>1或log2FoldChange<-1(p<0.05)的转录分析中,剔除极端数据后,选取有代表性的基因进行聚类分析,其中54个基因与癌旁组织相比显著上调,11个基因显著下调(图1A)。在蛋白质组学分析结果中,在p<0.05处,2486个蛋白质表现出显著差异。在相同条件下,剔除极端数据后,选择具有代表性的蛋白质进行聚类分析,与癌旁组织相比,15个蛋白质显著上调,15个蛋白质显著下调(图1B)。
转录组分析表明,6828个基因在患者样本中与邻近组织中存在差异表达。在蛋白质组学数据中,共有6187个蛋白质得到了差异表达。在两组数据中总共有2131个差异表达的基因(图1C)。对这两组数据的相关性分析表明,在转录和蛋白质组数据中存在差异表达的基因,如图1D所示。蓝点代表了两个具有相同组学表达趋势的基因。火山图也是使用OmicStudio工具进行的(图1E)。此外,我们评估了在特定筛选条件下喉癌组织中上调基因的意义、组织中的蛋白质含量以及差异表达倍数,并鉴定了上调表达的基因。
其中,TMA7在RNA和蛋白质水平上均有上调。因此,我们选择TMA7作为目的基因。统计分析表明,喉癌组织中TMA7的表达水平在蛋白质水平和RNA水平均高于癌旁组织。根据喉癌组织中TMA7的表达情况分析其临床病理特征(表1)。如表1所示,喉癌TMA7高表达患者的临床分期(***p<0.001)和T分期(**p<0.01)均较高。此外,TMA7升高的患者有淋巴结转移(***p<0.001)和频繁复发(**p<0.01)。然而,TMA7的表达与年龄、性别和原发部位无关。此外,Kaplan-Meier生存曲线显示TMA7升高与预后不良相关(图1F-G)。因此,TMA7的IHC是在喉癌和癌旁组织中进行的,如图1H所示。
图1 TMA7作为癌基因在喉癌组织中表达上调
2、TMA7影响喉鳞状细胞癌的增殖、侵袭、迁移和凋亡
为了阐明TMA7在LSCC细胞中的生物学功能,我们用慢病毒TU177、AMC - HN8和TU212的shRNA转染LSCC细胞系来KD TMA7的表达(TMA7-KD)。RT-qPCR和Western blot证实TMA7被成功敲除(图2A, B)。集落形成和EdU检测显示TMA7-KD抑制细胞增殖(图2C, D)。Transwell分析显示,TMA7 KD降低了LSCC细胞的侵袭性(图2e)。随后,通过伤口愈合试验进行评估了LSCC细胞的迁移能力降低,随后TMA7水平下降(图2F)。在LSCC细胞TMA7-KD后,细胞的凋亡率增加(图2G)。综上所述,这些结果表明TMA7-KD减弱了LSCC细胞的增殖、侵袭、迁移和集落形成能力,增加了细胞的凋亡率。
图2 TMA7影响喉鳞状细胞癌的增殖、侵袭、迁移和凋亡
3、TMA7与喉癌细胞自噬相关
为了研究TMA7与下游分子之间的调控相关性,我们对三个LSCC细胞系及其相应的TMA7 KD细胞系进行了RNA-SEQ检测。相关下游RNA分子的表达水平发生了变化。我们还发现,在FC≥1.5且p<0.05的截止点TMA7-KD上调了945个基因,下调了2521个基因。接下来,我们筛选出了泛素样修饰物激活酶2(UBA2),它通过添加小蛋白SUMO(参见SUMO 1;MIM 601912)或类泛素化来调节蛋白质结构和细胞内定位,从而实现蛋白质的翻译后修饰。我们发现它的mRNA水平降低,经过GO分析,它与蛋白质结合有关。数据库分析表明,它在UniProt预测的细胞质中表达。UBA2-KD促进肾透明细胞癌细胞的凋亡。本研究讨论了与细胞凋亡和自噬相关的表型,因为细胞凋亡和自噬与癌症有关。因此,我们推测UBA2除了与细胞凋亡有关外,是否还与自噬有关,这在以前还没有描述过。本研究探讨了UBA2与自噬表型相关途径的调控关系,并选择UBA2作为TMA7的下游基因进行进一步研究。
为了研究喉鳞状细胞癌TMA7-OE细胞生物学功能的变化,将TMA7-OE慢病毒导入LSCC细胞。RT-qPCR结果显示,TMA7-OE慢病毒感染LSCC细胞后,TMA7的表达相应增加(图3A)。TMA7-OE慢病毒从Genecem(MD,美国)获得。此外,我们进行了Western印迹以验证LSCC细胞TMA7的OE和KD(图3B)。结果表明,TMA7在LSCC细胞中成功地过表达或沉默(图2B,图8A),蛋白质含量相应地增加和减少。为了研究LSCC细胞中的自噬和TMA7,我们检测了与自噬相关的蛋白:P62、LC3B-I和LC3B-II。TMA7-OE后,细胞自噬减弱,p62表达增加,LC3B-II/I比值降低。TMA7-KD提供了相互矛盾的结果(图3B)。
用黄色自噬小体(mCherry和GFP)和红色自噬溶体(MCherry)标记的串联荧光报告基因(mCherryGFP-LC3)直接监测自噬通量。因此,黄点和红点分别表示自噬小体和自噬溶体。用腺病毒(mCherry-GFP-LC3、韩恒、中国)感染用TMA7OE或KD感染的LSCC和对照细胞。共聚焦显微镜显示,单个细胞的黄点和红点的比例不变,但点数增加。分析表明,自噬-溶酶体代谢没有改变,总体自噬水平增加。TMA7-KD后自噬增加,TMA7-OE后自噬减少(图3C)。UBA2的表达在TMA7-KD后减少,TMA7-OE后增加(图3B)。因此,我们推测UBA2可能是TMA7的下游分子,并被选中进行进一步的研究。
图3 TMA7与喉鳞状细胞癌自噬相关
4、IGF2BP3在喉癌细胞中的癌基因功能
对来自多个数据集的差异表达基因的分析表明,除了TMA7上调外,IGF2BP3在喉癌组织中也上调。在LSCC细胞中,IGF2BP3-KD或-OE后,IGF2BP3水平成功改变(图4A-B)。免疫印迹显示IGF2BP3-KD后IGF2BP3、TMA7和UBA2表达降低,而IGF2BP3-OE后IGF2BP3、TMA7和UBA2表达增加。为了研究IGF2BP3与LSCC细胞自噬的相关性,我们检测了自噬相关蛋白P62和LC3B。IGF2BP3-OE后,自噬减弱,p62增加,Lc3B-II/I比值降低。相反,IGF2BP3的下调导致了相反的结果(图4C)。
接下来,我们研究了IGF2BP3对LSCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。克隆形成、EDU、伤口愈合和Transwell分析表明IGF2BP3-KD抑制LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭(图4D-f,4h),而IGF2BP3-OE促进相反的结果。IGF2BP3-KD后LSCC细胞的凋亡增加,IGF2BP3-OE后LSCC细胞的凋亡减少(图4G)。IGF2BP3-KD后自噬水平增强,IGF2BP3-OE后自噬水平减弱(图4I)。
IGF2BP3促进LSCC细胞迁移、增殖和侵袭,减少细胞凋亡和自噬,调节TMA7和UBA2的表达水平。
图4 IGF2BP3在喉癌细胞中起癌基因的作用
5、IGF2BP3通过m6A甲基化调控TMA7
m6A在mRNA调控中起重要作用。TMA7 mRNA的3’-未翻译(UTR)序列包含一个典型的m6A修饰基序,该基序由生物信息学分析(图5A)管理。为了预测m6A修饰的可能位点,我们对MEME进行了基序预测,得到了预测的m6A修饰位点序列RRACH(D=A、G或U;R=A或G;H=A、U或C)。m6A甲基化修饰发生在基序的A碱基上(图5B)。Western印迹分析表明,在TU212细胞中的TMA7正义RNA探针下拉样本中存在IGF2BP3(图5C)。为了证明IGF2BP3与TMA7之间的相互作用,我们进行了RIP实验,结果表明IGF2BP3可能与TMA7结合(图5D)。接下来,我们在TU212中进行了MERIP,并在TMA7的3’-UTR区域发现了一个m6A修饰位点。因此,我们选择了上述序列并进行了下一步的验证。MERIP后的RT-qPCR分析(m6A RIP)进一步证实了m6A修饰的TMA7 mRNA(图5E)。与促进蛋白质翻译的潜在作用相一致,减少TMA7 mRNA的m6A修饰降低了TMA7蛋白的表达和新生TMA7蛋白的合成。(图4C)。随后,我们得出结论:IGF2BP3直接与TMA7的mRNA分子结合。IGF2BP3 OE或KD后,用Actinomycin D检测TMA7 mRNA在LSCC细胞上的稳定性。如前所述,提取总RNA用于RT-qPCR分析。计算指定时间点的mRNA表达,并根据GAPDH的表达进行标准化。因此,我们得出结论,IGF2BP3的消除可以缩短TMA7 mRNA的半衰期。IGF2BP3-OE延长了TMA7 mRNA的半衰期(图5F,g)。
图5 IGF2BP3通过m6A甲基化识别和结合TMA7
6、UBA2在喉癌细胞中的癌基因功能
在用RNA-seq(图3)分析了差异表达基因后,我们选择UBA2作为TMA7的下游分子,用于TMA7-KD之后的下一步研究。
据报道,UBA2在癌症中起主要作用,但它在喉癌中的作用尚不清楚。目前的数据表明,LSCC细胞中的UBA2-OE或UBA2-KD成功地改变了UBA2的表达(图6A-C)。为了阐明UBA2和自噬在LSCC细胞中的作用,我们对自噬相关蛋白P62和LC3B进行了研究。UBA2的OE减少了自噬,增加了p62,降低了LC3B-II/I比值。UBA2的破坏导致LC3B-II/I升高,p62降低(图6C)。
接下来,我们研究了UBA2对LSCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。克隆形成、EDU、伤口愈合和Transwell分析表明,UBA2-KD抑制LSCC细胞的增殖、迁移和侵袭,而UBA2-OE促进这种差异(图6D-G)。UBA2-KD后细胞凋亡率增加,UBA2-OE后细胞凋亡率降低(图6H)。此外,当UBA2缺失时,自噬增加,而当UBA2过度表达时,自噬减弱(图6I)。先前的一项研究证明,TMA7的水平与UBA2(图3B)有关;因此,我们进行了co-IP实验。结果表明,这两个分子直接相互作用(图6J),表明两个分子可能相互结合。结果表明,UBA2在喉鳞状细胞癌中起癌基因作用。在UBA2和TMA7之间建立了结合关系。
图6 UBA2在喉癌细胞中的癌基因功能
7、TMA7通过UBA2和PI3K/mTOR途径影响LSCC自噬
在TMA7-KD后,我们用RNA-seq富集PI3K-mTOR通路,发现PI3K-mTOR通路与TMA7的变化有关。因此,我们进一步研究了TMA7对PI3K-mTOR信号通路的影响。Western印迹分析表明,TMA7-KD减少,而TMA7-OE增加了PI3K和mTOR的磷酸化水平(图7A)。推测TMA7可以激活PI3K-mTOR信号通路。自噬通量分析表明,UBA2-OE减弱了TMA7-KD引起的自噬增加,而UBA2-KD增强了TMA7-OE引起的自噬减少(图7C)。
为了评估PI3K-mTOR信号通路在TMA7介导的自噬抑制中的重要性,我们用雷帕霉素处理TMA7-OE LSCC细胞。Western印迹和自噬通量分析表明,当3-MA处理TMA7-KD LSCC细胞时,抑制PI3K磷酸化可以重新激活被TMA7-OE抑制的自噬,而PI3K磷酸化的激活再一次抑制了由TMA7-KD激活的自噬(图7B,C)。此外,UBA2-OE还可挽救TMA7-KD引起的细胞增殖、侵袭和迁移的减少。此外,UBA2-KD挽救了TMA7-OE引起的细胞增殖、侵袭和迁移(图7D,7F-H)。UBA2-OE挽救了TMA7-KD引起的细胞凋亡增加,而UBA2-KD拯救了TMA7-OE引起的细胞凋亡减少(图7E)。因此,我们推测TMA7与UBA2相互作用,并通过PI3K/mTOR信号通路调节喉癌自噬水平。
图7 TMA7通过UBA2和PI3K/mTOR途径影响LSCC自噬
8、IGF2BP3通过TMA7调节LSCC自噬和UBA2表达
为了验证TMA7在IGF2BP3介导的抑制自噬中的重要性,用TMA7-KD感染IGF2BP3-OE LSCC细胞,用TMA7-OE慢病毒处理IGF2BP3-KD LSCC细胞。Western印迹显示,TMA7-KD可抑制IGF2BP3-OE诱导的UBA2上调和自噬抑制。而IGF2BP3-KD对UBA2的下调和自噬的激活则被TMA7-OE拯救(图8A)。在此,TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD诱导的细胞增殖、侵袭和迁移的减少。相反,TMA7-KD挽救了IGF2BP3-OE诱导的细胞增殖、侵袭和迁移的增加(图8B-E)。
结果表明,TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD引起的细胞凋亡增加。此外,TMA7-KD还挽救了IGF2BP3-OE引起的细胞凋亡的减少(图 8F)。自噬通量表明TMA7-OE减弱了IGF2BP3-KD诱导的自噬增加。相反,TMA7-KD增强了IGF2BP3-OE诱导的自噬的减少(图8G)。
因此,我们得出IGF2BP3和TMA7之间的相互作用,且IGF2BP3通过TMA7调节LSCC中UBA2的表达和自噬。
图8 IGF2BP3通过TMA7调节LSCC自噬和UBA2表达
9、TMA7影响LSCC细胞自噬诱导的顺铂耐药
为了检查TMA7是否调节喉癌对顺铂的化疗敏感性,我们构建了顺铂耐药的AMC-HN-8/DDP和TU212/DDP细胞。结果显示,TMA7增加可促进细胞活力并诱导顺铂处理细胞的化疗耐药性,而RAPA则使细胞对顺铂处理敏感。雷帕霉素可能会改变TMA7对LSCC细胞耐药性的影响(图9A-D)。RAPA降低了IC50,而TMA7-OE增加了IC50(图9E)。
此外,我们替换了自噬抑制剂雷帕霉素,雷帕霉素可以抑制自噬并检测自噬相关蛋白。Western blotting显示TMA7-OE增加了p62并降低了LC3B-II/I比率,而雷帕霉素触发了顺铂耐药细胞的自噬(图9F)。
接下来,我们检查了TMA7对顺铂耐药细胞中PI3K-mTOR信号传导的影响。Western blot表明TMA7-OE增加,而雷帕霉素降低mTOR磷酸化水平。此外,TMA7-OE降低了BAX、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的水平,而雷帕霉素增加了这些蛋白的水平,表明由于顺铂耐药细胞的凋亡水平较低(图9G),TMA7-OE激活顺铂耐药细胞中的PI3K-mTOR通路。
自噬通量表明雷帕霉素减弱了TMA7-OE诱导的自噬减少(图9H)。在裸鼠体内,用TMA7-KD转染的LSCC细胞(n=5)治疗,另一组用TMA7-KD和UBA2-OE转染的TU212稳定细胞治疗(n=5),第三组注射TU212细胞。所有裸鼠饲养34天。异种移植数据显示,低水平的TMA7显著抑制异种移植瘤的生长,而UBA2-OE增强喉癌的致瘤性(图9I,K,L)。
与未处理的LSCC细胞相比,TMA7-KD细胞中的自噬小体由线粒体结构组成,表明TMA7-KD激活了线粒体自噬并触发了随后的自噬(图9J)。
图9 TMA7对自噬诱导LSCC细胞顺铂耐药的影响
综上所述,目前的研究表明,TMA7在喉鳞状细胞癌中升高,与预后不良有关。TMA7是一种癌基因,调节喉癌细胞的增殖、侵袭、凋亡、自噬和化疗敏感性。TMA7通过UBA2调节PI3K/mTOR通路,而IGF2BP3以m6A依赖的方式调节PI3K/mTOR通路。因此,这项研究可能为喉癌提供潜在的分子标记和治疗靶点(图9M)。
实验方法
WB、转录组学和蛋白质组学多组学分析、集落形成试验、Transwell侵袭试验
参考文献:
Yang L, Yan B, Qu L, Ren J, Li Q, Wang J, et al. IGF2BP3 Regulates TMA7-mediated Autophagy and Cisplatin Resistance in Laryngeal Cancer via m6A RNA Methylation. Int J Biol Sci. 2023;19(5):1382-400. Epub 2023/04/15. doi: 10.7150/ijbs.80921. PubMed PMID: 37056932; PubMed Central PMCID: PMCPMC10086756.