METTL3通过激活JAK1/STAT3信号通路促进结直肠癌进展

        METTL3介导的N6-甲基腺苷（m6A）修饰在多种癌症中的作用已被阐明，但其在结直肠癌中发挥作用的具体机制仍不清楚。本研究中，作者发现在结直肠癌中，上调的甲基转移酶样3（METTL3）在基因调控中发挥依赖于甲基转移酶活性和不依赖于甲基转移酶活性的两种功能。JAK1和STAT3的增加共同促进p-STAT3信号通路的激活，并进一步上调包括VEGFA和CCND1在内的下游效应物的表达，最终导致体外和体内癌细胞增殖和转移的增强。机制上， METTL3将m6A沉积在JAK1转录本的3'非翻译区，依靠YTHDF1的识别促进JAK1的翻译。此外，METTL3被重新分配到STAT3启动子上，并与NF-κB协同促进STAT3的转录，而这是独立于METTL3甲基转移酶活性实现的。总之，该研究揭示了METTL3作为m6A writer和转录调控因子的双重作用，它们在同一信号通路中共同作用，驱动结直肠癌恶性发展。该研究于2023年11月发表在《Cell Death & Disease》，IF：9.0。

技术路线：

主要研究结果：

1. m6A和METTL3在结直肠癌中上调

        为探究m6A机制在结直肠癌中的作用，研究人员利用Northern点印迹技术检测10个配对的癌症组织和正常组织切片中的总RNA m6A水平。软件分析表明，与正常组织相比，癌症组织中的 m6A 水平呈上调趋势，这表明 m6A 在结直肠癌的发展过程中起着协同促进作用（图 1A）。随后，利用生物信息学方法筛选人大肠癌中的甲基转移酶和去甲基化酶（METTL3/14、WTAP、FTO和ALKBH5）的表达情况，发现只有甲基转移酶的催化核心METTL3在癌组织中较正常组织有显著上调（图1B）。更重要的是，转移灶的METTL3表达高于原发肿瘤（图 1C），凸显METTL3与恶性肿瘤的关系。然后，通过Western印迹和免疫组化染色评估METTL3在临床样本中的蛋白水平表达（图1D、E）。与mRNA分析结论一致，与配对的正常组织相比，结直肠癌和转移样本中的METTL3蛋白水平明显升高。此外，与正常人结肠上皮细胞（FHC）相比，所有检测到的人结直肠癌细胞系都显示出METTL3表达增加和 m6A 修饰水平上调（图 1F，G）。上述数据表明，METTL3 和 m6A 的上调与结直肠癌的恶性程度和进展有关。

图1. m6A和METTL3在结直肠癌中上调

2. METTL3在结直肠癌细胞中的协同促进作用

        为进一步阐明METTL3介导的m6A靶向基因调控机制，利用慢病毒介导的shRNA转染技术建立METTL3稳定下调的结直肠癌细胞。在HCT116和LoVo 细胞系中，METTL3 的敲除效率分别通过实时定量 PCR 和 Western 印迹得到证实（图 2A，B）。进行细胞增殖、集落形成和MTT试验。与对照组相比，METTL3 减少的癌细胞对细胞增殖和集落形成有明显的抑制作用（图 2C，D）。Transwell显示，METTL3 基因敲除显著削弱 HCT116 和 LoVo 细胞的迁移能力（图 2E）。细胞增殖抑制通常是由细胞周期停滞或细胞死亡引起的。因此，通过流式细胞术检测癌细胞的细胞周期和细胞凋亡。与对照组相比，METTL3沉默的细胞中有更多的细胞被抑制在G1/G0期，停留在G2/M期的细胞比例明显下降（图2F），但细胞凋亡在这两组之间没有观察到明显的差异（图2G）。因此，METTL3可能通过调节细胞周期和迁移而发挥共促进作用，但并不依赖于细胞凋亡。

图2. METTL3在结直肠癌细胞中的协同促进作用

3. 沉默METTL3对JAK1/STAT3信号通路的影响

        考虑到METTL3对RNA修饰的作用，研究人员通过点印迹法检测METTL3 缺失的癌细胞中RNA m6A的水平。与对照组相比，沉默METTL3后，癌细胞中的m6A水平明显下降（图 3A），这与之前的报道一致。为解读METTL3对m6A 靶基因表达的作用，研究人员对敲除METTL3的HCT116细胞进行甲基化RNA 免疫沉淀和RNA测序（MeRIP-seq）。测序结果显示，大部分m6A峰分布在mRNA 3'UTR和翻译停止点附近的位点，m6A 沉积量最高（图 3B），这与之前的测序结果一致。挑出m6A峰值发生变化（log2 ≥ 1）的基因进行通路富集统计。其中，JAK/STAT 信号通路的出现引起注意（图3C）。对JAK1/STAT3信号通路的状态进行研究，Western印迹结果显示，沉默METTL3显著抑制STAT3在Tyr705 残基上的磷酸化。令人惊讶的是，在METTL3敲除的癌细胞中也观察到JAK1和STAT3表达的明显下降，而对照组则没有（图3D）。为明确METTL3调控JAK1和STAT3的表达是否依赖于其甲基转移酶活性，使用m6A抗体沉淀含m6A修饰的RNA，并对其进行了定量实时PCR检测。为排除脱靶的可能性，设计两种针对 STAT3 不同位点的成对引物。实时 PCR 结果显示，敲除METTL3后，带有m6A修饰的JAK1 mRNA量减少，但带有m6A修饰的STAT3 mRNA量没有差异（图3E），表明 METTL3 可能以一种与 m6A 无关的方式介导 STAT3 的表达。

        随后，利用CRISPR-Cas9技术在HCT116中构建METTL3基因敲除细胞。经过单细胞选择后，用 Western blot 检测十个细胞的结肠，发现只有结肠-4（KO-C4）和结肠-7（KO-C7）显示出 METTL3 基因敲除效率（图3F）。对于 JAK1/STAT3通路分析，METTL3 基因敲除细胞的Western印迹检测结果与 METTL3 基因敲除细胞的结果相同（图3G）。实时 PCR 检测发现，METTL3 基因敲除在 mRNA 水平上显著下调STAT3的表达，但对JAK1 mRNA的表达没有影响（图 3H）。为进一步验证 METTL3 介导的对 JAK1 和 STAT3 的调控并非脱靶效应，在METTL3 基因敲除细胞中外源过表达野生型METTL3（WT-METTL3）和失去甲基转移酶活性的突变型 METTL3（D395A/W398A）。发现，无论是WT-METTL3还是突变体METTL3的过表达都能挽救STAT3的表达，但只有WT-METTL3能挽救JAK1的表达，突变体METTL3的过表达对JAK1的影响减弱（图 3I）。上述数据表明，METTL3以m6A依赖的方式在蛋白水平上调控JAK1的表达，而不是在mRNA水平上，并影响STAT3 mRNA的表达，从而共同促进结直肠癌细胞中JAK1/STAT3信号通路的激活。

图3. 沉默METTL3对JAK1/STAT3信号通路的影响

4. YTHDF1以m6A依赖性方式促进JAK1 mRNA翻译

        使用蛋白酶抑制剂 MG132 来阻断蛋白酶体介导的蛋白降解。发现，MG132 处理未能补充METTL3敲除介导的JAK1下调（图4A），表明METTL3可能参与JAK1翻译。在 HCT116 细胞系中构建稳定沉默YTHDF1的细胞（图4B）。Western印迹检测显示，YTHDF1敲除能有效抑制STAT3磷酸化，降低JAK1的表达水平，但对STAT3的表达没有影响（图4C）。进行RNA 相关免疫沉淀（RIP）和实时定量 PCR（图 4D），发现JAK1 mRNA富集在YTHDF1免疫沉淀物中，METTL3基因敲除后，这种相互作用明显减弱（图4E，F），突出m6A在YTHDF1和JAK1 mRNA相互作用中的不可或缺性。通过扫描HCT116中的MeRIP-seq数据，发现JAK1 mRNA 3'UTR中分布着大量置信度极高的m6A峰，并预测出4个潜在的m6A位点（图4G）。将 JAK1 3'UTR 序列克隆到双荧光素酶 pmirGLO 载体中，并分别构建潜在 m6A 位点发生单碱基替换的突变载体（图4H）。荧光素酶检测结果表明，与野生型相比，转染位点3和位点4存在m6A突变的载体的细胞，其荧光素酶活性明显减弱，这意味着位于JAK1 mRNA 3'UTR位点3和位点4的m6A修饰是m6A介导的JAK1转录后调控的原因（图4I）。此外，与对照组相比，YTHDF1的缺失也导致荧光明显下降（图4I），这进一步验证YTHDF1在识别JAK1 m6A位点中的重要作用。上述数据表明，METTL3对JAK1表达的调控功能是通过YTHDF1识别m6A位点来增强靶基因翻译的能力来实现的。

        然后，研究YTHDF1在结直肠癌细胞中的作用。沉默YTHDF1明显抑制细胞增殖和集落形成（图 4J，K），与对照细胞相比，YTHDF1 缺失细胞的迁移能力也受到影响（图4L）。此外，流式细胞术分析表明，停留在M期的细胞比例下降，更多的细胞停滞在S期（图4M），这与在METTL3沉默细胞中观察到的结果一致。综合上述数据，METTL3依赖YTHDF1与JAK1 m6A位点的结合能力促进JAK1翻译，导致STAT3通路激活和癌症进展。

图4. YTHDF1以m6A依赖性方式促进JAK1 mRNA翻译

5. METTL3和NF-κB共同调控STAT3转录

        使用放线菌素D中断细胞的RNA合成。实时PCR检测表明，在放线菌素 D暴露下，METTL3基因敲除组与对照组STAT3 mRNA降解率无明显差异（图 5A），说明STAT3 mRNA 降解不受METTL3影响。利用免疫荧光检测METTL3 在HCT116细胞中的位置，发现METTL3大部分定位于细胞核中，在细胞质中几乎观察不到任何信号（图5B）。随后，参考已发表的METTL3和METTL14的ChIP-seq数据（GSE141992）进行生物信息学分析，发现METTL3结合位点在STAT3启动子特异性地靠近转录起始点附近非常丰富（图5C）。令人惊讶的是，在 STAT3 启动子区域也发现NF-κB 的足迹（图5C），这表明METTL3可能与 NF-κB协同调控STAT3的转录。随后，在HCT116 细胞中分别对METTL3和 NF-κB进行ChIP 检测。分离 PCR 产物，发现STAT3启动子片段出现在 METTL3和NF-κB沉积物中，而抗IgG组中没有（图5D，E），这表明 METTL3/NF-κB与STAT3启动子直接相互作用。

        随后，通过共免疫沉淀也证实METTL3与NF-κB之间的直接相互作用（图5F）。为进一步探讨NF-κB是否具有调控 STAT3 表达的能力，用siRNA抑制癌细胞中NF-κB 的表达，发现 STAT3 的表达适度下降（图 5H）。此外，在线数据挖掘显示，在临床病理结直肠癌样本中，NF-κB和STAT3的表达呈正相关（图5G），这为 NF-κB在调控 STAT3 表达中的作用提供新的证据。最后，将包含转录起始位点上游450 bp和下游40 bp的序列构建成启动子活性检测质粒（图5I）。此外，构建已知NF-κB结合位点突变的相同序列，并转染到癌细胞中进行启动子活性检测。与野生型组相比，NF-κB突变明显降低STAT3启动子的活性，而且这种抑制作用在METTL3基因敲除的癌细胞中进一步扩大（图5I）。上述数据共同表明，METTL3和NF-κB协同促进STAT3的转录。

图5. METTL3和NF-κB共同调控STAT3的转录

6. p-STAT3 信号失调的下游效应

        对METTL3沉默的癌细胞中VEGFA的表达情况进行调查。METTL3的缺失在mRNA水平和蛋白水平上都明显抑制了VEGFA 的表达（图 6A，B）。根据研究结果，METTL3沉默通过诱导细胞周期停滞来抑制细胞增殖。在METTL3 缺失的细胞中，CCND1 的表达明显下降，同样的结果也在YTHDF1沉默的癌细胞中得到证实（图 6C，D）。这些数据表明，METTL3可能通过激活JAK1/STAT3信号通路来调控VEGFA和CCND1的表达。使用 STAT3小分子抑制剂Stattic 阻断HCT116癌细胞中STAT3的磷酸化。Western印迹显示，STAT3的活性受stattic的抑制呈剂量依赖性，其下游因子包括VEGFA和CCND1在stattic处理后也出现下调（图6E）。此外，stattic剂量依赖性地影响HCT116癌细胞的集落形成和迁移（图6F，G）。数据库分析显示，与正常人群相比，VEGFA、CCND1 和 YTHDF1在结直肠癌组织中的表达均上调（图6H）。在几乎所有分析的癌症类型中，METTL3与其靶标（包括JAK1、VEGFA、CCND1和STAT3）之间的表达相关性均为阳性（图6I）。总之，上述数据揭示STAT3 信号通路在METTL3介导的结直肠癌细胞增殖和迁移中发挥重要作用。

图6. JAK1/STAT3 信号失调的下游效应

7. METTL3和YTHDF1促进体内肿瘤生长和转移

        将缺失或未缺失METTL3的结直肠癌细胞皮下注射到 BALB/c裸鼠体内。METTL3基因敲除有效延缓肿瘤生长（图7A），因为与对照组相比，METTL3 基因缺失组的异种移植物的重量和大小均显著减少（图7B、C）。随后，建立肺转移小鼠模型，尾静脉注射HCT116对照组细胞会导致严重的肺转移，而缺失METTL3则几乎完全消除转移结节的形成（图 7D，E）。所有这些都证实 METTL3通过促进细胞增殖和转移在结直肠癌发生中的致癌作用。

        将YTHDF1缺失的癌细胞注射到裸鼠体内，建立肿瘤小鼠和肺转移小鼠模型。YTHDF1沉默后，肿瘤负荷明显减轻（图7F-H），与对照组相比，注射YTHDF1缺失细胞的小鼠肺组织切片中出现的转移结节更少（图 7I，J）。此外，STAT3 信号相关蛋白的表达水平在METTL3或YTHDF1缺乏的异种移植物中有所降低（图7K），这与在细胞中观察到的结果一致。总之，研究结果表明METTL3 以依赖和不依赖 m6A 的方式同时上调JAK1和STAT3的表达，从而促进STAT3 信号的激活，导致结直肠癌在体外和体内的增殖和进展（图8）。

图7. METTL3和YTHDF1促进体内肿瘤的生长和转移

图8. 结直肠癌细胞中METTL3介导的STAT3信号通路激活示意图

结论

        综上所述，本研究表明，METTL3通过上调JAK1和STAT3的表达，以m6A 依赖性和非依赖性的方式，促进p-STAT3信号通路的激活，从而促进结直肠癌的进展。因此，同时抑制p-STAT3 和METTL3可为结直肠癌治疗带来新的视角。

实验方法

        细胞培养，细胞增殖和克隆形成实验，Transwell，细胞周期研究，WB，实时定量PCR，稳定敲低和敲除细胞系的建立，m6A点印迹，m6A RNA免疫沉淀，RNA相关免疫沉淀，ChIP，RNA降解测定，蛋白质稳定性，荧光素酶检测，动物模型构建

参考文献

        Sun Y, Gong W, Zhang S. METTL3 promotes colorectal cancer progression through activating JAK1/STAT3 signaling pathway. Cell Death Dis. 2023 Nov 25;14(11):765. doi: 10.1038/s41419-023-06287-w. PMID: 38001065; PMCID: PMC10673931.