口腔病原体通过促进小鼠Th1细胞浸润而加重帕金森病

       帕金森病(PD)是一种常见的慢性神经系统疾病，致残风险高且无法治愈。牙周炎是一种发生在牙周支持组织中的感染性细菌疾病。研究表明牙周炎与PD密切相关。然而，缺乏牙周炎对PD影响的直接证据。在本研究中，我们证明了使用龈下菌斑(LIP-SP)结扎诱导的牙周炎加重了MPTP诱导的PD小鼠的运动功能障碍、小胶质细胞激活和多巴胺能神经元丢失。16S rRNA基因测序显示LIP‑SP诱导口腔和肠道生态失调。特别是，在MPTP + LIP-SP处理的小鼠粪便样本中，来自口腔结扎的小韦荣球菌(V. parvula)和变形链球菌(S. mutans)增加。我们进一步证明，小韦荣球菌和变形链球菌在LIP-SP介导的PD小鼠运动功能障碍和神经变性恶化中发挥了关键作用。小韦荣球菌和变形链球菌引起PD小鼠脑内小胶质细胞活化，脑、颈淋巴结、回肠和结肠内Th1细胞浸润。此外，我们观察到IFNγ中和对小韦荣球菌和变形链球菌处理的PD小鼠多巴胺能神经元的保护作用。总之，我们的研究表明口腔病原体加剧MPTP诱导的PD小鼠的运动功能障碍和神经退行性变。本文于2023年11月发表于“Microbiome”（IF=15.5）上。

技术路线：

结果：

1）LIP-SP加重MPTP诱导的PD小鼠运动功能障碍和多巴胺能神经元丢失

       为了评估牙周炎对MPTP诱导的PD小鼠运动功能和多巴胺能神经元损失的影响，我们首先进行LIP，并每周应用三次SP诱导牙周炎。1个月后，我们通过腹腔注射MPTP诱导小鼠PD(图1A)。行为学测试显示，与对照组相比，MPTP显著减少了滚轴试验中的潜伏时间和悬挂试验得分(图1B)。LIP-SP损害了MPTP诱导的PD小鼠滚轴试验和悬挂试验的运动功能(图1B)。我们通过表征酪氨酸羟化酶(TH)在ST和SN中的表达来检测LIP-SP对多巴胺能神经元损伤的影响。正如预期的那样，IHC显示MPTP处理导致ST中TH阳性纤维减少近50%(图1C-1D)，SN中TH阳性多巴胺能神经元减少近50%(图1E-1F)。重要的是，与MPTP组相比，MPTP-LIP-SP导致ST(图1C-1D)和SN(图1E-1F)中多巴胺能神经元的显著减少。与此观察结果一致，western blot分析显示MPTP诱导PD小鼠ST中TH蛋白水平较对照小鼠显著降低。LIP-SP加重了MPTP处理后TH蛋白的损失(图1G-1H)。LIP-SP对对照组小鼠的多巴胺能神经元水平没有显著影响(图1C-1H)。此外，免疫荧光分析显示LIP-SP加速了MPTP诱导的PD小鼠SN中的小胶质细胞活化(图1I-1J)。单独使用LIP和SP均不会加重MPTP诱导的PD小鼠的多巴胺能神经元损失(补充图)，提示PD的加重需要口腔病原体与牙周炎的结合。

2）LIP-SP可以改变MPTP诱导的PD小鼠的口腔和肠道微生物群

       先前的研究已经证实了肠道生态失调在PD中的作用，我们假设LIP-SP可能通过口肠轴影响PD的发病机制。我们采用16S rRNA基因测序对小鼠口腔及粪便进行分析。α多样性分析显示，MPTP组和MPTP + LIP-SP组口腔和肠道样本中Faith的系统发育多样性(Faith’s pd)有显著差异。MPTP + LIP-SP处理的小鼠口腔和肠道微生物组的多样性明显高于MPTP处理的小鼠(图2A)。β多样性分析显示，MPTP组和MPTP+LIP-SP组之间的口腔和肠道微生物组成存在显著差异(图2B)。接下来，我们使用随机森林分析来鉴定潜在的致病菌。与MPTP处理小鼠相比，MPTP+LIP-SP处理小鼠的口腔结扎和粪便中富集了口腔病原菌小韦荣球菌和变形链球菌(图2C)。接下来，我们采用qRT-PCR方法检测了口腔结扎和粪便中小韦荣球菌和变形链球菌的DNA水平。与MPTP组相比，MPTP+LIP-SP组口腔结扎和粪便中小韦荣球菌和变形链球菌的DNA水平明显升高(图2D-2E)。

3）LIP-mix加重MPTP诱导的运动功能障碍和多巴胺能神经元丢失

       我们随后研究了小韦荣球菌和变形链球菌对MPTP诱导的PD的影响。LIP-mix小鼠模型先进行LIP，然后每周3次给药，持续1个月，然后注射MPTP诱导PD(图3A)。正如预期的那样，通过行为测试确定，腹腔注射MPTP会损害运动功能。与MPTP组相比，MPTP+LIP-mix组滚轴试验潜伏时间缩短，悬挂试验评分明显降低(图3B)。在不腹腔注射MPTP的情况下，LIP-mix不影响运动功能(图3B)。此外，LIP-mix增强了MPTP诱导的ST和SN的多巴胺能神经元损伤。MPTP注射后，ST和SN中多巴胺能纤维和神经元数量明显减少，LIP-mix处理导致MPTP诱导的PD小鼠ST和SN中多巴胺能神经元进一步减少(图3C-3F)。ST中TH阳性蛋白水平也呈现出类似的趋势(图3G)。但对照组和LIP-mix组之间多巴胺能纤维和神经元水平无显著差异(图3C-3G)。然后我们进行了额外的实验，在没有LIP诱导的情况下，小鼠口服小韦荣球菌和变形链球菌，然后用MPTP诱导PD(图S4A)。我们发现，在没有LIP的情况下，这两种细菌几乎不会在肠道中定植(图S4B)，也不会加重PD(补充图)。这些数据表明，小韦荣球菌和变形链球菌需要牙周炎的存在才能在小鼠肠道中定植，并对PD产生加重作用。

4）LIP-mix刺激MPTP诱导的小鼠脑小胶质细胞活化和CD4+T细胞浸润

       为了研究大脑中的神经炎症，我们用流式细胞术分析了脑组织样本。与对照组相比，MPTP组小胶质细胞(CD45low CD11b+)和CD4+T细胞(CD3+ CD4+)的数量显著增加(图4A, 4B)。值得注意的是，LIP-mix处理进一步增加了MPTP诱导的PD小鼠大脑中小胶质细胞和CD4+T细胞的数量(图4A, 4B)。接下来，我们用流式细胞术检查了颈部淋巴结、回肠和结肠中的免疫细胞。与MPTP组相比，MPTP + LIP-mix组颈部淋巴结的CD4+T细胞显著增加，但对照组与MPTP组之间没有差异(图4C)。同样，LIP-mix组与MPTP组相比，MPTP+LIP-mix组的CD4+ T细胞数量增加(图4D)。值得注意的是，MPTP组的结肠中CD4+T细胞数量比对照组增加。MPTP+LIP-mix组进一步增加了这一比例(图4E)。

5）LIP-mix促进MPTP诱导的PD小鼠中Th1细胞的积累

       我们进一步用流式细胞术分析CD4+T细胞的亚型。在脑组织中，与对照组小鼠相比，MPTP诱导的PD小鼠中Th1细胞(CD4+ IFNγ+)增加，MPTP+LIP-mix处理的小鼠比MPTP处理的小鼠显示更多的Th1细胞(图5A)。然后，我们检查了颈部淋巴结、回肠和结肠中的外周Th1细胞。在颈淋巴结和回肠中，MPTP+LIP-mix组与MPTP组相比Th1细胞明显增加，但对照组与MPTP组之间没有差异(图5B, 5C)。值得注意的是，MPTP组结肠中Th1细胞数量比对照组增加，LIP-mix处理进一步刺激了MPTP诱导的PD小鼠中Th1细胞的积累(图5D)。

6）中和IFNγ可减轻MPTP + LIP-mix处理小鼠的多巴胺能神经元损失

       由于IFNγ是Th1细胞分泌的主要细胞因子，我们使用IFNγ中和抗体来验证Th1细胞是否在多巴胺能神经元损失的加剧中起关键作用(图6A)。MPTP+LIP-mix组ST中TH阳性蛋白水平显著降低(图6B)。IFNγ中和并没有阻止MPTP处理小鼠TH阳性蛋白损失，但减轻了MPTP+LIP-mix处理小鼠TH阳性蛋白的减少(图6B)。同样，IHC结果显示LIP-mix加剧了MPTP处理小鼠ST和SN中多巴胺能纤维和神经元的丢失(图6C-6F)。中和IFNγ对MPTP处理的小鼠没有影响，但减轻了MPTP+LIP-mix处理的小鼠的神经元损失(图6C-6F)。

结论：口腔病原体小韦荣球菌和变形链球菌在牙周炎的情况下加重PD的严重程度。从机制上讲，小韦荣球菌和变形链球菌改变口腔和肠道微生物群，诱导外周和脑区Th1细胞浸润，从而增强小胶质细胞激活，导致神经退行性变。我们的研究揭示了口腔病原体加重PD的机制，为PD的预防和治疗提供了新的方向。

实验方法：行为测试，Western blot，IHC，免疫荧光，16S‑rRNA测序，qRT‒PCR，流式。

参考文献：Bai XB, Xu S, Zhou LJ, Meng XQ, Li YL, Chen YL, Jiang YH, Lin WZ, Chen BY, Du LJ, Tian GC, Liu Y, Duan SZ, Zhu YQ. Oral pathogens exacerbate Parkinson's disease by promoting Th1 cell infiltration in mice. Microbiome. 2023 Nov 17;11(1):254. doi: 10.1186/s40168-023-01685-w.