外泌体支架成功加速伤口愈合

       源自人体皮肤的工程皮肤替代品可显着减少由外来/人造材料介导的炎症反应，因此更易于临床应用。I型胶原蛋白是伤口愈合过程中细胞外基质的主要成分，具有优异的生物相容性，富含血小板的血浆可作为愈合级联的引发剂。脂肪间充质干细胞衍生的外泌体对于组织修复至关重要，在增强细胞再生、促进血管生成、调节炎症和重塑细胞外基质方面发挥着关键作用。在此，I型胶原蛋白和富含血小板的血浆混合形成稳定的3D支架，为角化细胞和成纤维细胞粘附、迁移和增殖提供天然支持。将脂肪间充质干细胞衍生的外泌体添加到支架中，以改善工程皮肤的性能。分析了该细胞支架的理化性质，并在全层皮肤缺损小鼠模型中评估其修复效果。细胞支架可降低炎症水平并促进细胞增殖和血管生成，从而加速伤口愈合。蛋白质组学分析表明，外泌体在富含胶原/血小板的血浆支架中表现出优异的抗炎和促血管生成作用。该方法为组织再生和伤口修复提供了新的治疗策略和理论基础。本文于2023年10月发表在《Advanced Materials》期刊上，IF=29.4

主要技术路线：

主要研究结果：

1、胶原（COL）/富含血小板的血浆（PRP）支架的设计和表征

       伤口发生后，伤口周围血浆渗出，血小板立即被激活释放血小板衍生生长因子（PDGF）促进血栓形成，形成凝胶状团块覆盖伤口，这是伤口愈合反应的初始阶段。PRP的提取和应用可用于模拟愈合级联的启动。此外，趋化因子招募的成纤维细胞通过胶原蛋白沉积修复伤口。愈合后期，血管和肉芽组织形成，角化细胞覆盖创面。为了模拟伤口愈合微环境，使用COL-I和PRP生成生物支架，并添加成纤维细胞和角化细胞层。合成示意图如图1A所示。PRP和COL-I以不同质量比混合，加入10 μL mL−1凝血酶形成支架的主网络。对支架的材料性能进行了测试。根据3D孔径、弹性模量和拉伸强度选择PRP的最佳质量比后，添加成纤维细胞和外泌体，然后接种角化细胞以覆盖支架表面。然后使用四组评估COL/PRP支架对伤口愈合的影响：纯PRP组和质量比为16:1、8:1和4:1的PRP/COL-I组。具有高度多孔结构的支架对于实现细胞迁移和“爬行”、不同细胞层之间的相互作用以及营养物质流动至关重要。首先，对不同质量比的COL/PRP支架的微观结构进行了表征。不同质量比的COL/PRP支架表现出均匀的3D互连多孔结构（图1B），孔径范围为20至120 μm，并且随着PRP质量比的减小，孔径逐渐减小。对于直径为17-20 μm的成纤维细胞来说，这个孔径可以为细胞生长提供足够的面积和空间。本研究证实COL/PRP可以形成3D立体生物支架结构，为细胞粘附、迁移和增殖提供环境支持。COL/PRP支架的弹性模量，即抗变形能力，在质量比为8:1时最大，达到463±0.252 kPa（图1C）。支架的组织粘合性质使其能够保持与伤口的结合，降低使用过程中脱落的风险。搭接剪切试验用于评估不同质量比下COL/PRP支架的组织粘附性能。每组的粘附强度约为5 kPa（图1D），组间无显着差异，证实COL/PRP支架满足伤口表面粘附要求。8:1组的拉伸强度最高，达到220.6±3.725 kPa（图1E）。苏木精-伊红（H&E）染色也显示出均匀的孔隙结构，并且随着PRP质量比的降低，结构变得更致密，孔径逐渐减小（图1F）。

       此外，为了评价COL/PRP支架是否具有良好的生物相容性，进行了活体/死亡实验。每组支架分别与成纤维细胞（图1G）和角化细胞（图2A）共培养3d。成纤维细胞和角化细胞的活/死细胞染色仅见少量死亡细胞，与正常对照组结果相似，活细胞定量分析无明显差异（图1H和2D），证实该支架具有良好的细胞相容性。Ki67是用于评估细胞增殖的主要标志物。将不同质量比的COL/PRP支架与成纤维细胞和角化细胞共培养，并用Ki67染色（图2B、C）。免疫荧光结果表明，8:1质量比组表达Ki67的成纤维细胞和角化细胞丰度最高（图2E、F）。这些数据证实质量比为8:1的COL/PRP支架比其他组的COL/PRP支架具有更好的性能和更大的细胞增殖促进作用。因此，后续实验均采用8:1的质量比。按照设计过程（图1A），PRP和COL-I以8:1的质量比混合，并将105 cm−2成纤维细胞添加到1毫米厚的支架上。混合后，加入10 μL mL−1凝血酶以固化支架。细胞生长2天后，将105 cm−2的角化细胞接种到表面。如图2G所示，角化细胞均匀分布在支架表面，形状令人满意，外观呈鹅卵石状。此外，支架中角化细胞特异性标记物K14和成纤维细胞特异性标记物