在恶性横纹肌样肿瘤中， SMARCB1缺失激活了患者特异性远端致癌增强子

       恶性横纹肌样瘤（MRT）是一种高度恶性且通常致命的儿童癌症。 MRT 在基因上由 SMARCB1 的双等位基因失活突变定义，SMARCB1 是 BRG1/BRM 相关因子 (BAF) 染色质重塑复合体的成员。 BAF 复合体成员的突变在人类癌症中很常见，但在许多情况下，人们对它们对肿瘤发生的贡献仍知之甚少。在这里，我们研究了 MRT 背景下 SMARCB1 丢失导致的监管环境脱轨。我们对源自患者的 MRT 类器官的多组学方法揭示了 SMARCB1 重组后监管格局的巨大重塑。染色体构象捕获实验随后揭示了远端增强子区域与 MYC 癌基因启动子的患者特异性环。联合单细胞 RNA-seq 和 ATAC-seq 显示，这种 MYC 增强子利用的肿瘤间异质性也存在于患者 MRT 组织中。我们发现 SMARCB1 的缺失会激活 MRT 肿瘤发生背后的患者特异性表观遗传重编程。

       该研究于2023年12月发表在《Nature communications》，IF：16.6。

结果:

1、MRT PDOs 中的染色质动力学分析揭示了 SMARCB1 依赖性增强子调节

       我们先前证明了SMARCB1的丧失是恶性转化所必需但不足够的。因此，我们假设肿瘤形成需要额外的表观遗传学驱动因子。将MRT的主要遗传驱动事件SMARCB1丧失重新引入，将MRT细胞恢复到正常状态，表明促使恶性的表观遗传变化是可以克服的（图1A）。为了找到这些促使肿瘤发展的调控性变化，我们对一种MRT PDO模型（命名为P103）进行了慢病毒转导，分别使用荧光素酶表达（对照）或SMARCB1表达（SMARCB1+）质粒，通过转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）以及染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）或使用核酸酶测序进行靶点切割和释放测序（CUT&RUN）来测量染色质可及性（图1A、B）。在SMARCB1重建后，我们发现了7,941个新形成的开放染色质区域（OCRs），这些区域富集了来自不同家族的转录因子结合位点，如SMARCC1/2和AP-1（图1C）。SMARCB1 ChIP-seq显示这些OCR被SMARCB1（cBAF和PBAF）和SS18（ncBAF和cBAF）结合，表明在重建后这些区域存在cBAF的结合。当我们使用GREAT对这些OCR进行功能注释时，发现多个类别富集，主要与分化和发育过程相关。在失去的1,211个OCR中，观察到了ncBAF复合物成员BRD9和SS18的结合明显减少。我们发现这些区域中唯一富集的基序是隔离蛋白CTCF的基序，与之前在人类胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中的报告一致

       CTCF的ChIP-seq结果显示，在SMARCB1重建后，CTCF在SMARCB1+细胞中失去的OCR上的结合减少（图1C）。在基因组中，CTCF的结合经常与环形粘连复合物的结合重叠。粘连复合物亚单位RAD21的ChIP-seq证实，除了CTCF结合减少外，SMARCB1+细胞中失去的OCR显示了粘连复合物的结合减少（图1C）。另一方面，在SMARCB1+ PDO中增益的OCR显示了RAD21的占有（图1C），但没有CTCF的结合。为了确定SMARCB1重建后增强子景观的变化，我们进行了H3K27ac活性增强子标记的ChIP-seq。如预期，失去的OCR显示H3K27ac水平下降，而增加的可及性位点则显示H3K27ac水平显著增加（图1C）。活性增强子标记的增加与粘连复合物的结合增加相一致（图1C），这与一部分粘连复合物分子结合到（超级）增强子区域以及CTCF结合位点一致。这些结果表明，经典BAF复合物在抑制CTCF结合到染色质方面起着重要作用，并且SMARCB1的丧失导致CTCF结合到染色质的可及性增加，以及ncBAF复合物结合到肿瘤特异OCR。

图1| SMARCB1 重建重塑了 MRT PDO 模型中开放的染色质景观。

2、SMARCB1 重建重组了 MYC 癌基因周围的染色质景观

       观察到在SMARCB1重建后CTCF和RAD21结合景观的变化使我们假设，这些细胞中可能影响了长距离基因调控。为了确定基因组的组织（3D基因组）是否发生了任何依赖于SMARCB1的变化，我们在对照和SMARCB1+ P103 MRT PDOs中进行了高分辨率原位HiC实验。尽管CTCF对染色质的结合存在差异，但我们发现染色质结构基本上没有受到影响。3D基因组特征，如拓扑相关域（TADs）和A/B区，SMARCB1重建后显示出有限的变化。然而，我们分别鉴定了控制和SMARCB1+ PDO的131个和1,164个特异loop，其最小接触频率变化为1.5倍（图2C）。在SMARCB1重建后，对最显著失去的基因座进行排名，我们发现MYC癌基因的启动子与一个大约1.1 Mb的远程区域之间存在相互作用（图2A，C）。这个loop是SMARCB1重建后第六个最减少的相互作用，也是涉及原癌基因的排名最高的相互作用。这个MYC启动子的远程区域具有高H3K27ac水平，表明这是一个超级增强子（图2A，B）。

       在MRT的背景下，MYC癌基因尤为引人关注，因为我们和其他研究先前证明，MRT是通过SMARCB1依赖的MYC基因表达特征来定义的。类似地，我们观察到在SMARCB1重建后MYC mRNA和蛋白水平明显减少，以及细胞周期相关基因的失调，表明存在细胞周期停滞（图2D）。此外，通过shRNA诱导的MYC敲除在MRT PDOs中导致细胞增殖显著减少（图2E），表明MYC对MRT的生长是必需的。除了MYC表达的减少外，我们观察到在SMARCB1重建后，超级增强子以及MYC启动子的染色质可及性显著减弱（图2A，B）。为了探讨SMARCB1重建是否影响ncBAF复合物的结合，我们对BRD9（ncBAF）和SS18（cBAF和ncBAF）进行了CUT&RUN。我们发现在SMARCB1重建后，BRD9和SS18在MYC启动子以及1.1 Mb远程区域的结合显著减少（图2B）。这些结果表明，MYC表达至少在很大程度上取决于ncBAF复合物的结合。SMARCB1的重建减少了ncBAF复合物在MYC位点的结合，从而可能减少了MYC启动子与远程超级增强子的相互作用。

图2| SMARCB1 重建影响 MRT PDO 中 MYC 癌基因的远端增强子

3、患者特异性超级增强子与 MRT 中的 MYC 相互作用

       我们随后假设MYC远程增强子环路可能是推动MRT致癌的一种普遍机制。为此，我们在另外两个MRT PDOs（P78和P60）中进行了SMARCB1的重建。RNA-seq分析显示这两个MRT模型中MYC表达减少，以及细胞周期基因的失调，证实了细胞增殖停滞的诱导（图2D、E）。接下来，我们使用MYC启动子作为视点，对这两个额外的PDO进行了4C-seq，这是一种定向到特定基因组位点的染色体构象捕获方法。与P103类似，P78在SMARCB1重建后显示了MYC启动子与相同的约1.1 Mb远程基因组区域的减少接触频率（图3A）。值得注意的是，第三个PDO模型（P60）的4C-seq分析显示MYC启动子与我们先前确定的基因组区域没有相互作用。相反，在SMARCB1重建后，4C-seq揭示了另外两个染色质环路的减弱（图3A）。

       为了绘制PDO模型在存在和不存在SMARCB1时的调控景观，我们在P78和P60上进行了ATAC-seq。当我们将ATAC-seq数据与4C-seq数据叠加时，发现与MYC启动子相互作用的区域是高度可访问的。这种可访问性与患者特异的MYC启动子相互作用景观相关（图3B）。在SMARCB1重建后，相互作用的丧失与这些位点的可访问性丧失相一致（图3B）。在P78中的可访问染色质区域类似于我们在P103中确定的超级增强子。总体而言，我们将这些可能的超级增强子区域称为Rhabdoid Oncogenic MYC Enhancer（RhOME），并根据它们在基因组中的位置进行编号。值得注意的是，与RhOME2相反，RhOME1（PCAT1）和RhOME3（CCDC26）先前在其他肿瘤实体中已被确定为MYC的调控区域。因此，我们的Hi-C和4C实验揭示，在不同的MRT PDOs中，与MYC启动子相互作用的不同远程增强子是活跃的（RhOME1-3）。RhOMEs的肿瘤间特异性进一步突显了增强子RNA（eRNAs）的表达，这是活跃的超级增强子所特有的，特异地在这些增强子在MRT PDOs中是活跃的并与MYC启动子相互作用的情况下（图3C）。这些结果表明，SMARCB1的丧失导致了一种表观状态，其特征是形成长程启动子-增强子环路，这些环路对于PDO模型是特异的，但在来自不同供体的MRT PDOs之间是异质的。

       因为MRT PDOs在很大程度上保留了它们衍生自的组织的（表观）遗传特征，我们利用这些模型进一步探索患者特异的表观遗传程序，使用ATAC-seq（图4A）。为了对在P103中丧失的OCR进行分层，我们执行了K均值聚类，包括来自三个PDOs的ATAC-seq数据和P103的ChIP-seq数据（图4A）。因此，我们可以将失去的OCR分类为（K1）非增强子CTCF结合位点、（K2）弱增强子和（K3）独立于CTCF的超级增强子（图4A）。与超级增强子在细胞身份控制中的功能一致，我们鉴定了SOX蛋白结合位点，包括SOX2、SOX9和SOX17，以及与K3簇特异性开放染色质位点、RhOME2和3.1 OCR相关的许多发育过程的功能注释。此外，K3簇显示了ncBAF复合物的最高染色质占有率，由BRD9 CUT&RUN测量，其在恢复SMARCB1表达后显著减少。而K1和K2簇在三个PDO模型中显示了相似的可访问性模式，K3簇的可访问性丧失是特定于P103细胞系的（图4A）。我们在P103中的Hi-C分析显示，这些K3簇特异性超级增强子形成了绝缘边界，这在重建SMARCB1表达后被有效地废除（图4B、C）。因此，在MRT PDOs中的SMARCB1重建与基因组拓扑、BAF复合物占有率和增强子活性方面发生了戏剧性但局部、患者特异性的变化。

图3|不同 MRT PDO 中患者特异性 MYC 增强子组的鉴定。

图4|患者特异性超级增强子在 SMARCB1null 肿瘤 PDO 中形成独立于 CTCF 的 TAD 边界。

4、MYC 增强子可塑性反映在患者 MRT 中

       到目前为止，我们的数据引发了一个有趣的可能性，即在增强子利用的水平上存在推动MYC癌基因表达的肿瘤间异质性。为了将我们的体外发现推广到患者组织，我们首先检查了来自患者MRT组织的公开可获得的H3K27ac ChIP-seq数据。如预期，MYC启动子在大多数患者样本中都标有高水平的H3K27ac，表明活跃的转录（图5A）。此外，RhOME1-3处广泛富集H3K27ac，显示了在MRT PDOs中鉴定的肿瘤超级增强子景观在MRT组织中的保留。在STJ0090和STJ0537中未能检测到RhOME1-3的清晰峰值，而在MYC启动子处检测到弱的H3K27ac信号。值得注意的是，与我们的PDO数据一致，不同患者样本中在不同的RhOME位点检测到H3K27ac峰的存在呈异质性分布（图5A）。

       为了评估是否在肿瘤内存在差异的增强子利用，即肿瘤内异质性，我们利用单细胞Multiome（10x Genomics）对七个MRT患者组织样本进行了联合单细胞RNA-seq和ATAC-seq（图5B）。经过过滤，留下14,799个细胞用于进一步的分析，每个肿瘤中的中位数为2040个细胞（图5C）。通过细胞类型标记基因41和SMARCB1表达将正常和肿瘤细胞进行了分配。均匀流形逼近和投影（UMAP）空间显示，肿瘤细胞按患者进行了聚类，而非恶性细胞按细胞类型进行了聚类（图5C）。MYC表达以及MYC启动子的OCR在所有MRT和一些正常细胞聚类中都有发现（图5D）。然而，尽管在正常细胞中检测到可察觉的MYC启动子信号，但几乎在RhOME1-3中没有检测到可访问的染色质，这表明在至少这些样本中，这些超级增强子是肿瘤特异性的。至关重要的是，我们观察到在不同的患者MRTs中，RhOME1-3的OCR组合是不同的（图5D、E）。更具体地说，尽管P156和P168仅由RhOME2处的OCR定义，但P041和P052主要显示RhOME1和RhOME3处的OCR，并且在P166中仅在RhOME3处检测到OCR。在P116和P138中在任何RhOME中都没有发现OCR，这表明在这些肿瘤中通过RhOME1-3以外的调控元件发生了超生理激活MYC。总体而言，这些结果表明，在MRT中，存在在超级增强子活性水平上推动MYC癌基因表达的肿瘤间异质性。

图5 | MRT 组织分析揭示了 MYC 增强子景观的肿瘤间和肿瘤内异质性

5、ncBAF 抑制诱导类似于 SMARCB1 重建的基因表达特征

       最近的研究表明，MRT可能由ncBAF复合物在MRT细胞中异常定位所驱动。因此，抑制ncBAF亚单位BRD9被证明是MRT中的一个潜在治疗易感性。因此，我们着手研究ncBAF抑制对MRT PDOs的影响（图6A）。为此，我们使用BRD9的药物抑制剂（I-BRD9）处理MRT PDOs。我们观察到，在形态上，MRT细胞呈现出与SMARCB1重建相似的分化表型（图6A），并且细胞生长显著受到抑制。定量RT-PCR（RT-qPCR）证实，BRD9抑制导致MYC mRNA水平显著下降（图6B）。我们进行了RNA-seq以进一步测量ncBAF抑制后的转录组变化，并发现I-BRD9处理后引起的基因表达变化与SMARCB1重建后的变化之间存在显著的关联（图6C）。为了在两个基因集之间统计确认差异，我们对这两个集合进行了Fisher确切性检验（图6D），确认了强烈的相似性。与增殖下降一致，我们观察到细胞周期相关基因集以及MYC靶基因的下调（图6E）。在上调的基因集中，我们发现了与分化相关的基因的富集（图6E），与用BRD9抑制剂处理的细胞的形态表型一致（图6A）。BRD9和SS18的CUT&RUN证实了在MYC启动子以及RhOME2和3位点的ncBAF复合物结合的减少（图6F）。更一般地，在I-BRD9处理后观察到BRD9和SS18的基因组范围内结合的丧失，这并不是由于处理引起的BRD9和SS18蛋白表达的降低引起的。因此，证实了治疗诱导的ncBAF复合物结合的丧失。因此，在MRT中抑制ncBAF复合物，消除了所有三个BAF复合物，呈现出重建SMARCB1表达的效应的表型。

       总的来说，我们的全面研究表明，由于SMARCB1丧失导致超级增强子活性的偏离支撑了MRT的肿瘤发生，并为揭示BAF复合物突变在各种癌症中对肿瘤发生的贡献提供了蓝图。

图 6 |通过使用药物抑制剂靶向名为 BRD9 的 ncBAF 亚基来治疗 MRT 患者

实验方法：

       慢病毒转导、定量RT-PCR、细胞活力测定、Western Blot、RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、CUT&RUN、Hi-C and 4C-seq、Motif分析、单细胞多组 ATAC + GEX。

参考文献：

       Liu, N.Q., Paassen, I., Custers, L. et al. SMARCB1 loss activates patient-specific distal oncogenic enhancers in malignant rhabdoid tumors. Nat Commun 14, 7762 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43498-3