SETD2-NR2F1-STAT1信号轴重塑肿瘤免疫微环境、增强免疫治疗疗效的新机制

        以免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors，ICIs）为代表的免疫治疗彻底改变了如肾细胞癌、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、乳腺癌等晚期癌症患者的治疗，但临床实践证明只有约20%的患者有效。SETD2突变与免疫检查点抑制剂（ICIs）免疫治疗的疗效有关。SETD2失活的功能重要性以及如何调节免疫治疗反应仍不清楚。为了探讨SETD2在免疫治疗中的作用，通过RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、流式细胞术、蛋白质免疫印迹等方法确定SETD2在ICI治疗中的作用，并阐明了对肿瘤免疫的机制影响，揭示了各种难治性癌症的新潜在治疗生物标志物，为SETD2缺失患者的免疫治疗策略提供了理论依据。该研究于2023年12月6日发表在《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》，IF：10.9

技术路线

主要研究结果

1. Setd2敲除基因小鼠模型中的肿瘤对ICI免疫治疗敏感

        为了测试敲除SETD2是否会使肿瘤对免疫检查点阻断敏感，作者建立了一个同源小鼠肿瘤细胞系：来自Pdx1cre小鼠自发性胰腺癌的KC细胞。使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术建立Setd2-KO的KC细胞（图1A）。为了确定Setd2对免疫治疗反应的影响，同等数量的KC-sgSetd2和对照细胞皮下移植到C57BL/6免疫活性小鼠中，然后腹腔注射PD-L1抗体。与载体对照相比，PD-L1治疗显著减少了KC-sgSetd2肿瘤的生长，但对对照组肿瘤大小没有影响（图1B-E）。这些结果表明，Setd2基因敲除可使胰腺癌对PD-L1免疫治疗敏感。为了验证该结论，作者又验证了Setd2（图1F）在第二个小鼠肿瘤细胞系（B16F10，小鼠黑色素瘤）中的作用，发现B16F10细胞中完全抵抗免疫检查点阻断，但对免疫功能正常小鼠中抗PD-L1治疗的有效性有显著影响（图1G-1 I）。相比之下，对照组B16F10肿瘤没有抑制作用（图1I和1J）。因此，敲除Setd2使KC胰腺癌和B16F10黑色素瘤对免疫检查点阻断敏感。

图1：Setd2敲除使小鼠肿瘤对PD-L1免疫治疗敏感

2. SETD2失活通过上调Stat1激活IFNγ通路

        为了确定由Setd2调节的全基因表达模式，作者在配对的KC-KO/KC-WT C57BL/6同种异体移植肿瘤体内和KC-sgSetd2/KC对照细胞体外进行RNA-seq。GSEA显示，在KC-KO肿瘤和KC-sgSetd2细胞中，调节免疫反应、细胞因子产生、干扰素-γ（IFNγ）反应、抗原加工和提呈的基因集显著上调（图2A）。IFNγ通路在肿瘤对免疫治疗的反应中起着关键作用。在KC-KO肿瘤和KC-sgSetd2细胞中，IFNγ通路中的关键转录因子STAT1 27显著上调和激活（图2B和2C）。在B16F10-sgSetd2细胞中，通过WB和RT-qPCR进一步证明了SETD2-STAT1调节（图2D和2E）。此外，SETD2失活在体外（图2F和2G）和体内（图2H）上调了IFNγ诱导的趋化因子基因Cxcl9，Cxcl10和Cxcl11。STAT1-IFNγ调节轴被报道通过招募CXCR3+CD8+T细胞和CXCR3+NK细胞来促进抗肿瘤免疫。综上所述，这些结果表明敲除Setd2增加了STAT1的表达和激活，然后激活了IFNγ通路，从而促进免疫相关基因的表达和免疫相关通路的激活。

图2：敲除Setd2诱导STAT1表达和激活

3. 敲除SETD2促进PD-L1表达和抗原递呈

        众所周知，IFNγ-JAK-STAT1轴是促进PD-L1表达和MHC-I抗原加工和呈递的主要途径。在作者的Setd2缺陷小鼠模型中，除了趋化因子基因之外，还发现PD-L1的表达和抗原递呈增强。在Setd2敲除细胞和同种异体移植肿瘤中，通过RT-qPCR在转录水平证实了Pdl1的上调（图3A和3B）。如图3C和3D所示，细胞膜上的PD-L1蛋白表达增加。据报道，PD-L1的上调导致有效的免疫抑制和肿瘤免疫逃逸，这解释了Setd2缺陷肿瘤发生免疫抑制的潜在原因。RT-qPCR还显示Setd2敲除细胞中MHC-I复合物核心基因H2K1的上调（图3E），细胞表面的H-2Kb /Db蛋白表达水平持续增加（图3F）。体内进一步证实了H2-K1的上调（图3B）。GSEA结果显示敲除Setd2促进MHC-I抗原加工和提呈。此外，细胞中SIINFEKL-H-2Kb水平上调（图3G），体外和体内试验表明敲除Setd2使KC细胞对CD8+OT-1细胞介导的杀伤更敏感（图3H）。

图3： 敲除Setd2促进IFNγ-STAT1诱导的PD-L1表达和MHC-I抗原递呈

4.失活SETD2通过下调Nr2f1促进Stat1表达

        SETD2的大部分功能由H3K36me3介导，进行ChIP-seq绘制H3K36me3在KC-WT和KC-KO中的分布，观察失活SETD2通过H3K36me3缺失诱导染色质可及性和转录输出的改变。通过ATAT-seq评估敲除Setd2后对Stat1表达的染色质可及性的影响。ChIP-seq和ATAC-seq显示H3K36me3沉积和Stat1染色质可及性没有显著差异，表明Stat1可能表达间接受Setd2调控。转录水平上Stat1的减少使作者确定了敲除Setd2可能调节增加Stat1转录的潜在转录因子的表达。Nr2f1是差异表达基因中最显著的下调转录因子，且敲除Setd2的细胞中ChIP-seq的H3K36me3富集和ATAC-seq的染色质可及性的下降（图4A和4B）。为了通过实验研究Stat1转录是否由NR2F1调节，将Nr2f1慢病毒转导到Setd2敲除和对照细胞中（图4C），并通过RT-qPCR和WB（图4D）证实Stat1表达的降低，且一系列IFNγ诱导的基因下调（图4E）。此外，为了评估NR2F1是否直接与Stat1启动子结合，作者构建了Flag-Nr2f1慢病毒载体，并确定了其抑制STAT1表达和激活的能力。通过ChIP-qPCR检测证实了直接结合（图4F）。此外，GFP报告基因检测显示NR2F1显著抑制了Stat1启动子驱动的GFP表达（图4G和4H）。这些结果表明了敲除Setd2是通过降低Nr2f1基因体上的H3K36me3沉积和减少Nr2f1启动子区域近端的染色质可及性，从而进一步增加了STAT1的表达和激活。

图4： Setd2失活通过下调Nr2f1表达诱导STAT1表达和激活

5. SETD2失活重编程肿瘤免疫微环境

        为了系统地阐明SETD2-NR2F1-STAT1轴对肿瘤免疫微环境的调节，作者建立了Setd2-敲除（KC-KO）和Setd2-野生型（KC-WT）细胞系，并在C57BL/6同种异体移植肿瘤中进行RNA-seq。通过单样本基因集富集（ssGSEA）和ESTIMATE分析，KC-KO肿瘤的免疫细胞浸润显著高于KC-WT肿瘤（图5A）。许多免疫相关基因，包括免疫抑制基因Cd274、Ctla4、Lag3和Ido1，在KO肿瘤中上调。此外，一些免疫刺激基因和趋化因子如Ccl5和Cxcl10基因的表达，在KO肿瘤中也上调（图5B）。PBS治疗的C57BL/6免疫活性小鼠分离的敲除Setd2和对照中分选CD45+免疫细胞的单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析显示，浸润T细胞、中性粒细胞、NK细胞和树突状细胞的比例显著增加，而与对照相比，Setd2缺陷肿瘤中浸润巨噬细胞的比例显著降低（图5C和5D）。鉴于肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的双重功能，作者们将巨噬细胞重新聚集到M1样和M2样巨噬细胞中，发现这两种类型的巨噬细胞比例都有所下降，而在Setd2缺陷肿瘤中，M2样巨噬细胞急剧减少（图5E和5F）。鉴于T细胞在抗肿瘤免疫中的关键作用，作者又根据其功能和标记基因注释了T细胞亚群（图5G）。在Setd2敲除的同种异体移植物中，初始和效应T细胞亚群（包括初始CD4+T细胞、调节性CD4+T细胞（Treg）、CD4+辅助T细胞、初始CD8+T细胞和效应CD8+T细胞）的浸润显著增强，主要表现为效应CD8+T细胞和Treg的增加（图5H）。这些结果表明Setd2下降是通过减少M2巨噬细胞浸润和增加效应T细胞浸润来加剧肿瘤微环。为了进一步探索CD8+T细胞在PD-L1治疗中的作用，评估了CD8+T细胞的状态。结果表明，在PD-L1免疫治疗的KC-sgSetd2肿瘤中，细胞毒性CD8+T细胞的比例显著增加（图5I和5J），PD-L1免疫治疗调节CD8+T细胞的分化，使其在Setd2表达和Setd2敲除肿瘤中从耗尽状态转为细胞毒性状态。流式细胞术分析进一步证实， PD-L1治疗显著增加了Setd2敲除的皮下同种异体移植体中CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润（图5K和5L）。综上可知，一方面，Setd2缺乏促趋化因子的产生，通过增加T细胞的浸润来刺激免疫微环境，增强抗原递呈，激活CD8+T细胞介导的杀伤。另一方面，STAT1的激活促进免疫抑制检查点分子如PD-L1的表达，与抗肿瘤免疫相竞争。所有这些机制都有助于ICI免疫治疗。

图5：肿瘤内免疫浸润的Bulk RNA-seq和scRNA-seq

6. 人类癌症中的SETD2-NR2F1-STAT1轴

        为了证实小鼠肿瘤中SETD2失活抑制STAT1表达且以NR2F1依赖性方式激活的发现，作者在人胰腺导管腺癌细胞系YAPC中用单个SETD2 sgRNA敲除SETD2（图6A）。在mRNA和蛋白水平上证实STAT1表达升高，在YAPC-sgSETD2细胞中也证实了STAT1激活介导CXCL10和PDL1的上调（图6A和6B）。接下来，作者进行了GSEA分析，以获得SETD2敲除和对照YAPC细胞转录组差异的全局视图。SETD2敲除的YAPC细胞中富集了几种途径，类似于KC-sgSetd2细胞中的基因特征（图6C），免疫相关基因的表达也像KC-KO细胞一样增加（图6D）。对胰腺癌队列公共数据集的分析显示，SETD2和STAT1表达、NR2F1和STAT1表达以及SETD2和PDL1表达之间存在负相关（图6E和6F）。根据SETD2和NR2F1的表达水平进一步完善了队列。非配对比较显示，在SETD2高表达的肿瘤中STAT1和PDL1的表达较低（图6G），在NR2F1低表达的肿瘤中STAT1的表达显著增加（图6G），这与小鼠肿瘤中的发现一致。接下来，基于SETD2表达水平的人类胰腺癌队列中差异表达基因的GSEA也显示了与SETD2敲除的YAPC细胞中鉴定的相同的富集基因特征。最后，用经过验证的SETD2和NR2F1抗体对75例胰腺导管腺癌患者组成的人体组织芯片进行免疫组化，并证明SETD2和NR2F1表达显著正相关（图6H和6I）。接下来，根据TCGA数据集，SETD2在透明肾细胞癌中以高患病率（16%）发生突变，这些突变中的大多数是失活突变，并导致完整蛋白质表达的丧失。通过TCGA和RECA-欧盟（ICGC）队列中ccRCC肿瘤的基因组分析显示，NR2F1和STAT1、SETD2的表达与免疫抑制基因CTLA-4、IDO1、HAVCR2和LAG3呈负相关（图6J），SETD2和NR2F1的表达呈正相关（图6K）。SETD2高表达肿瘤中NR2F1的mRNA水平显著高于SETD2低表达和SETD2失活肿瘤（图6L）。总体而言，这些结果表明SETD2-NR2F1-STAT1调节的机制在人类癌细胞系和患者样本中高度保守，突出了SETD2失活在ICI免疫治疗人类癌症疗效中的作用。

图6： 人类肾透明细胞癌和胰腺癌中的SETD2-NR2F1-STAT1轴

7. 携带SETD2突变的癌症患者可从ICI免疫治疗中获益

        检索并分析了1662例接受ICI免疫治疗的晚期癌症患者的基因组和临床结局数据。在476个癌症基因中，127个基因与免疫治疗的有益效果相关。排名靠前的基有已知的ICI治疗预测生物标志物，包括TP53、PAK7、TET1、PTPRD/PTPRT和STK11。SETD2在476个基因中排名前三。SETD2失活突变的患者免疫治疗的效果更好（图7A和7B）。这一结果在额外的黑色素瘤（图7C，D）和非小细胞肺癌队列中得到了外部验证。

图7： SETD2突变的患癌患者的ICI免疫治疗疗效更好

结论

        总体而言，作者从细胞系、基因小鼠模型和患者标本中获得的数据揭示了SETD2失活通过NR2F1-STAT1信号通路增强肿瘤免疫原性和激活肿瘤免疫微环境的重要意义。这项工作不仅为SETD2肿瘤抑制生物学提供了见解，还提供了SETD2突变癌症可以从ICI免疫治疗中受益的证据，突出了SETD2突变体在指导免疫治疗中的预测价值。

实验方法

        蛋白质印迹分析，细胞培养，小鼠实验，基因集富集分析（GSEA），流式细胞术，ChIP-seq，ATAC-seq，RNA-seq，ChIP-qPCR，批量RNA-seq和单细胞RNA-seq分析，轨迹分析，免疫组织化学染色

参考文献

        Zheng Xufen, Luo Yuxiang, Xiong Yangjie et al. Tumor cell-intrinsic SETD2 inactivation sensitizes cancer cells to immune checkpoint blockade through the NR2F1-STAT1 pathway. [J]. J Immunother Cancer, 2023, 11: undefined.