scRNA-seq和scATAC-seq整合分析发高分——揭示iNKT细胞发育轨迹

         与传统的αβT细胞不同，固有自然杀伤T细胞（iNKT细胞）在胸腺中完成其终末分化为功能性的iNKT1/2/17细胞。然而，指导iNKT亚群分化的潜在分子程序仍然不清楚。在这里，作者利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞转座可及染色质测序（scATAC-seq）对四个胸腺iNKT发育阶段的超过17,000个iNKT细胞的转录组和超过39,000个iNKT细胞的染色质可及状态进行了分析，以定义它们的发育轨迹。研究发现了iNKT前体和不同iNKT亚群的新特征，并表明iNKT2和iNKT17细胞系的发育可能在第0阶段（ST0）早期就通过两个不同的程序发生了，而iNKT1的发育可能发生在ST0之后。iNKT1和iNKT2细胞都表现出广泛的表型和功能多样性，而iNKT17细胞相对均一。此外，发现一个新的转录因子Cbfβ在iNKT前体中高表达，其表达轨迹与其他已知的iNKT细胞发育转录因子Zbtb16和Egr2相似，并且可以指导iNKT细胞命运并推动它们的效应器表型分化。通过条件性敲除Cbfβ，阻断了早期iNKT细胞的发育，并导致iNKT1/2/17细胞分化严重受损。总的来说，本研究揭示了不同的iNKT发育程序以及它们的细胞多样性，并确定了一个新的转录因子Cbfβ作为早期iNKT细胞发育的关键调节因子。本文于2023年6月发表在《Cell Discovery》IF: 33.5期刊上。

技术路线

主要实验结果：

1、通过scRNA-seq和scATAC-seq对胸腺iNKT细胞在连续发育阶段进行聚类

         为揭示iNKT细胞的发育景观，采用荧光激活细胞分选（FACS）技术从连续发育阶段中收集胸腺iNKT细胞，以进行scRNA-seq和scATAC-seq实验（图1a，b）。鉴于在C57BL/6小鼠中胸腺ST0（CD24+） iNKT细胞的稀缺性，利用Vα14-Jα18转基因小鼠（也称为rec-Vα14Tg）进行ST0 iNKT细胞分析，其TCR基因座与内源性TCR基因座非常相似，但具有丰富的ST0 iNKT细胞。如预期的，发现在rec-Vα14Tg和C57BL/6小鼠的ST0 iNKT细胞中，scATAC-seq谱的相似性很高。因此，进一步使用rec-Vα14Tg小鼠进行ST0 iNKT细胞的scRNA-seq分析，并使用C57BL/6小鼠进行ST1（CD24−CD44loNK1.1−）、ST2（CD24−CD44hiNK1.1−）和ST3（CD24−CD44hiNK1.1+） iNKT细胞的分析（图1a–c）。

         经过质量控制过滤和排除细胞异常值后，共保留了17,944个高质量的单一胸腺iNKT细胞，总共表达了13,578个基因，用于随后的scRNA-seq分析。在聚合的iNKT细胞（ST0–ST3）中鉴定16个簇，每个簇的细胞数量从255个到2817个不等（图1d，e）。每个簇中最显著差异表达的基因（DEGs）显示在热图中（图1f）和小提琴图中（图1g）。在这些簇中，有四个簇（C2，C4，C9和C14）来自ST0，八个簇来自ST1（C3，C5，C6，C7，C10，C11，C15和C16），九个簇来自ST2（C1，C3，C5，C6，C7，C10，C11，C13和C15），以及四个簇来自ST3（C1，C5，C8和C12）（图1d）。ST0 iNKT细胞明显与其他iNKT阶段分离，而来自ST1和ST2 iNKT细胞的簇有适度的重叠，而来自ST3 iNKT细胞的簇与来自ST2 iNKT细胞的簇紧密相邻（图1d）。此外，相关性分析表明，同一阶段内的不同簇呈相对相似的转录组模式。

图1 小鼠胸腺iNKT细胞的多样性

         细胞分化伴随着由顺式调控元件控制的基因的表达，这些元件必须处于开放状态才能正常发挥功能。因此，对与scRNA-seq分析中相同发育阶段的胸腺iNKT细胞进行了scATAC-seq分析，并绘制了单个iNKT细胞的染色质可及性景观。在与scRNA-seq数据整合后，这十六个iNKT细胞簇很容易识别（图2a）。由于scRNA-seq允许根据转录组推测当前细胞状态，作者根据其特征转录组和细胞因子转录表达，将每个簇（C1–C16）分配到已发表的iNKT1、iNKT2和iNKT17功能亚群中。结果发现来自ST1和ST2的C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇被分类为iNKT2亚群；来自ST3主要的C1、C5、C8和C12簇被分类为iNKT1（图2b）；而来自ST2的独特iNKT C13被分配到iNKT17（图2b）。ST0簇（C2、C4、C9和C14）在任何iNKT亚群中都不突出，因为它们没有表现出强烈的效应特征（图2b）。总体而言，通过整合转录组和表观遗传学特征，绘制了胸腺iNKT细胞的动态转录组和染色质景观，揭示了iNKT1和iNKT2细胞的异质性以及iNKT17细胞的相对同质性。

图2 不同的iNKT簇被分配到功能子集中

2、ST0中的两个发育轨迹

         胸腺中iNKT细胞的发育依赖于位于胸腺皮质的大约1000个ST0 iNKT前体细胞（iNKTp）。在这里，作者鉴定了ST0中的四个簇（C2、C4、C9和C14）（图1d和3a），并突出显示了每个簇的特定特征（图3b）。根据CD4和CD8的表达，这些ST0簇可以分为三组：C14是CD4+CD8+（DP）iNKTp；C9是CD4+CD8−（CD4SP）iNKTp，富含T淋巴细胞存活调节因子，包括Id2和Il7r；C2和C4是CD4−CD8−（DN）iNKTp，其中C4高度表达Cd5和Cd6，而C2 iNKTp丰富表达Egr2和Slamf6，它们分别通过调节PLZF表达和TCR信号强度，对iNKT细胞的发育至关重要（图3b–d）。尽管先前的研究声称iNKT细胞要么是CD4−CD8−（DN），要么是CD4+CD8−（CD4SP），但在ST0中确实发现了一个小的CD4+CD8+（DP）iNKTp簇（C14）（图3c–e）。

         将ST0 iNKTp组织成一个伪时间轨迹。鉴别了两个潜在的发育分支，即C14-C2-C4分支（称为DP-DN分支）和C14-C9分支（DP-CD4SP分支）（图3f）。这两个分支最终在表达趋化因子受体Ccr7增加的发育末端相遇（图3g），Ccr7在ST0 iNKTp从胸腺皮质迁移到髓质中是必需的。通过流式细胞仪在蛋白质水平上进一步确认了DP、DN和CD4SP iNKTp中Ccr7的表达模式（图3h）。因此， DP iNKTp下调CD8或同时下调CD4和CD8的表达，以启动在胸腺皮质中的DP-CD4SP或DP-DN发育程序，最终迁移到胸腺髓质。

3、ST0中功性能iNKT亚型谱系

         接下来，想知道ST0中这两个发育程序如何对iNKT亚型谱系产生影响。尽管PLZF被注释为关键的iNKT2标志，但它对整体iNKT细胞的发育也至关重要，包括iNKT1和iNKT17细胞。因此，首先评估了Zbtb16（编码PLZF）在ST0 iNKTp中的表达模式和染色质可及性。发现在DP iNKTp（C14）中，Zbtb16的+40 kb区域和TSS是不可及的，但在CD4SP（C9）和DN（C2和C4） iNKTp中是可及的，其中C2的开放性水平远高于C4，这与Zbtb16的表达模式非常相似（图3i，j）。伪时间轨迹和流式细胞仪进一步表明，Zbtb16在DN和CD4SP iNKTp中富集（图3j，k）。鉴于iNKT2分化需要比iNKT1和iNKT17更强的TCR信号，因此CD4SP中的PLZF高表达iNKTp（C9）更有可能进入iNKT2细胞谱系。

         RORγt是调控iNKT17分化的关键转录因子，但也高度表达于未被信号刺激的DP胸腺细胞，并促进iNKT细胞选择。与Zbtb16不同，在+4 kb区域的Rorc（编码RORγt）在DP（C14）和DN（C2和C4）iNKTp中是可及的，但在CD4SP（C9）簇中不可及，而+13 kb到Rorc只在DP iNKTp（C14）中可及。Rorc的表达模式与每个簇中的染色质可及性状态一致（图3l）。Rorc在DP iNKTp中显著高表达，并在DN分支（C4和C2）中逐渐下调，但在CD4SP（C4）中几乎不可检测（图3m），这在流式细胞仪中得到了进一步验证（图3n）。总体而言，基于伪时间的发育轨迹分析揭示了ST0可能存在两个潜在的发育程序，在这两个程序中，iNKT细胞可能启动对iNKT2和iNKT17细胞的发育，这早在ST0发生，而iNKT1细胞可能在ST0后启动。然而，这一假设仍在进一步调查中。

图3 ST0时期iNKT细胞的细胞多样性

4、iNKT2细胞的细胞多样性

         为了解ST0后iNKT子集的发展，将聚集的胸腺iNKT细胞(ST0 - 3)映射到伪时间轨迹中（图4a）。iNKT2细胞展示了广泛的多样性，包括C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇（图2b和4a, b）。首先评估了整合的iNKT细胞簇（C1–C16）中Zbtb16染色质的可及性。在Zbtb16位点的181 kb内，发现iNKT2、iNKT1和iNKT17簇中高度可访问的区域，但在ST0簇（C2、C4、C9和C14）中区域较弱。Zbtb16的表达与其染色质可及性密切匹配（图4c）。iNKT2簇和ST0中的C2和C9显示了GATA3结合活性的高活性，GATA3对iNKT2分化至关重要（图4d）。正如预期的那样，对于iNKT2细胞的大多数标志基因，它们在中间阶段逐渐增加，然后在终端分化期间下调。然而，一些基因，包括Btg1、Cebpb和Osgin1，仅在iNKT发育末端附近出现，这可能与iNKT2细胞的终末事件相关（图4e）。

         先前的研究表明，ST1和ST2中的iNKT细胞经历高度的增殖。细胞周期通路富集分析表明，iNKT2簇（C7、C11和C15）表现出高度增殖的特征，这些特征可能处于S期（C7）或G2/M期（C11和C15）（图4f）。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）表明，簇C3、C6、C10和C16在功能上存在差异。C16是从ST0到ST1的iNKT细胞的短暂阶段，这些细胞迅速上调了与糖酵解和氧化磷酸化都相关的基因的表达（图4g），表明它们对能量的需求增加。C6在ST1中终止，这些细胞富集了与TCR信号、共刺激信号、细胞骨架、TNFR以及细胞死亡和衰竭通路相关的基因（图4g）。总体而言，iNKT2展现出极大的细胞多样性。

图4 iNKT2细胞的细胞多样性

5、iNKT1细胞的异质性

         iNKT1细胞分化受转录因子Tbx21的调控，分为四个簇（C1、C5、C8和C12）（图2b和5a）。在Tbx21位点的17.2 kb内，启动子区域–3 kb和–4 kb在C1、C5和C12中高度可访问，但在C8中较不可访问（图5b）。这些相同的区域在ST1和ST2中的高增殖C7、C11和C15 iNKT2簇中也是可访问的。重要的是，Tbx21结合位点的活性也发生在这些簇中，而在ST0簇中则不是如此（图5c）。流式细胞仪分析进一步证实，ST1和ST2中的PLZFhiiNKT2细胞中有一小部分表达T-bet，并且通过Ki-67测量具有相当的增殖能力（图5d）。因此，iNKT1的前体可能隐藏在这些所谓的高增殖PLZFhiT-bethi iNKT2细胞中。

         伪时间轨迹分析发现一个新的标志基因，Slamf7，在iNKT1细胞簇中富集（图5e）。流式细胞仪进一步证实了这一点，基于PLZFloT-bethi iNKT1细胞中SLAM7和NK1.1表达之间的强相关性（图5f）。与其他iNKT1细胞簇相比，NK细胞相关的标志基因Slamf4进一步区分了末端的C12。SLAMF4+ iNKT细胞（C12）主要是DN，逐渐从PLZFloT-bethi iNKT1细胞中分化出来（图5g–i）。SLAMF4+ iNKT1细胞主要分泌IFN-γ，IL-4较少，类似于“经典iNKT1细胞”，而大多数SLAMF4− iNKT1细胞在刺激后分泌IL-4和IFN-γ（图5j）。C5细胞富集了参与干扰素信号通路的Ifit1和Ifit3（图5k）。总体而言，iNKT1细胞从ST1开始，起初表现为目前定义的“iNKT2细胞”，逐渐完成分化并最终转化为末端的SLAMF4+ iNKT1细胞，即经典的分泌IFN-γ的iNKT1细胞。

图5 iNKT1细胞具有广泛的细胞异质性

6、iNKT17细胞表现出有限的多样性

         C13被指定为iNKT17细胞，它在图2b和6a中与其他簇明显分开。观察到Rorc的+4 kb和+14 kb区域在ST0簇（C2、C4和C14）和成熟的iNKT17簇（C13）中是可访问的（图6b），并且RORC的结合位点在iNKT17簇以及ST0 iNKTp中也被激活（图6c）。这些数据表明，iNKT细胞可能在ST0开始其iNKT17分化，并在C13完成其分化。在mRNA水平上，Rorc在ST0的C14中高度表达，与Rorc的染色质可及性一致，但在C4和C2中逐渐下调，并在C13中重新上调，表明其他转录因子可能靶向开放的Rocr位点，并在iNKT17分化过程中调控Rorc的表达。

         为追踪iNKT17细胞的发育轨迹，进一步在一个有序的iNKT细胞轨迹中检查了iNKT17标志基因，并发现少数iNKT17标志基因，包括Rorc，在早期iNKTp中最初表达，然后在它们达到成熟的iNKT17之前。然而，大多数与iNKT17相关的标志基因在iNKTp中几乎不表达（图6d）。进一步发现一个新的标志基因， Aqp3，在胸腺iNKT17（PLZFintRORγt+）细胞中特异表达（图6e，f）。总体而言，iNKT细胞可能在ST0启动iNKT17分化，而这些iNKT17细胞表现出有限的多样性。

图6 iNKT17细胞表现出有限的异质性

7、Cbfβ调控iNKT细胞的早期分化

         先前的研究指出，Egr2和Slamf6通过调节Zbtb16的表达和TCR在ST0中控制早期iNKT细胞的发育。在这里，作者发现了一个新的共转录因子，Cbfβ，它与Egr2和Slamf6表现出相似的表达模式，并在iNKT细胞的ST0阶段表现出很高的富集，特别是在DP-DN分支C2中（图7a, b）。

         Cbfβ编码的CBFB是一个非DNA结合的调节亚基，通过异构增强RUNX（RUNX1、RUNX2和RUNX3）的特异性DNA结合能力，从而调节它们目标基因的转录。为确定Cbfβ是否调节iNKT发育，检查了胸腺特异性Cbfβ敲除小鼠（CD4CreCbfβ f/f，Cbfβ KO）中的iNKT细胞发育，其中Cbfβ1和Cbfβ2均被敲除。Cbfβ敲除导致胸腺iNKT细胞的频率和绝对数量显著减少（图7c）。进一步更全面的分析揭示了Cbfβ KO小鼠中ST2和ST3 iNKT细胞的选择性和显著减少。Cbfβ KO小鼠中ST0和ST1 iNKT细胞的频率显著增加，但在Cbfβ KO和WT对照组之间，绝对数量是可比的（图7d）。有趣的是，在Cbfβ KO小鼠的ST0 iNKT细胞中，DP iNKTp增加（图7e），表明Cbfβ的敲除部分阻断了DP iNKTp向CD4SP或DN谱系的转化。作者推测Cbfβ可能影响DP阶段的iNKT细胞选择。

         ST1 iNKT细胞经历迅速的增殖，并包含具有高Zbtb16编码PLZF表达的iNKT亚群的前体。在这里，观察到在Cbfβ KO iNKT细胞中，ST1时的PLZF表达显著下调（图7f）。在一个增殖标记Ki-67上也观察到了类似的现象（图7g）。这些数据表明，Cbfβ缺乏的iNKT细胞进入了相对静止状态，无法在ST1正常上调PLZF表达。此外，在ST1中残留的PLZF+ iNKT细胞未能共同表达T-bet以启动iNKT1分化，也未能共同表达RORγt以启动iNKT17分化（图7h，i）。总体而言，研究表明，Cbfβ在控制ST0时的早期iNKT细胞发育、ST1/2时的iNKT细胞分化以及ST3时的最终成熟中起到关键调节作用（图7j）。

图7 Cbfβ调控iNKT细胞早期细胞谱系

 实验方法：

         构建条件性敲除小鼠，流式细胞术，骨髓嵌合体移植实验，小鼠iNKT细胞富集和分选，qRT-PCR，WB，scRNA-seq，iNKT scRNA-seq数据集与参考文献的比较分析，scATAC-seq，scRNA-seq和scATAC-Seq的整合分析

参考文献：

         Wang J, Adrianto I, Subedi K, Liu T, Wu X, Yi Q, Loveless I, Yin C, Datta I, Sant'Angelo DB, Kronenberg M, Zhou L, Mi QS. Integrative scATAC-seq and scRNA-seq analyses map thymic iNKT cell development and identify Cbfβ for its commitment. Cell Discov. 2023 Jun 20;9(1):61. doi: 10.1038/s41421-023-00547-x. PMID: 37336875; PMCID: PMC10279728.