CTNNB1突变型肝细胞癌中靶向MMP9 可恢复CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫并提高抗PD-1功效
在肝细胞癌（HCC）中，功能增强（GOF）CTNNB1突变（CTNNB1GOF）引起明显的免疫逃逸，并对抗PD-1产生抗药性。在这里，我们的目标是调查CTNNB1GOF HCC介导的免疫逃逸机制，并提出一种新的治疗策略，以增强在HCC中抗PD-1的疗效。进行RNA测序以识别与免疫逃逸相关的CTNNB1GOF的关键下游基因。利用体外共培养系统、小鼠皮下或正位模型、在条件基因敲除小鼠中的自发性肿瘤模型以及流式细胞术，探索基质金属蛋白酶9（MMP9）在肿瘤进展和免疫逃逸中的生物学功能。利用单细胞RNA测序和蛋白质组学来深入了解MMP9的潜在机制。在CTNNB1GOF HCC中，MMP9显著上调。MMP9抑制了CD8+ T细胞的浸润和细胞毒性，这对于CTNNB1GOF引发抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）和抗PD-1抗性至关重要。从机制上讲，CTNNB1GOF下调了sirtuin 2（SIRT2），导致促进β-连环蛋白/赖氨酸去甲基酶4D（KDM4D）复合物形成，促进MMP9的转录激活。HCC分泌的MMP9介导了CD8+ T细胞中slingshot蛋白磷酸酶1（SSH1）的脱落，导致抑制C-X-C motif趋化因子受体3（CXCR3）介导的G蛋白偶联受体内的信号传导。此外，MMP9阻断重塑了TIME，并增强了在HCC中抗PD-1疗法的敏感性。CTNNB1GOF通过激活MMP9的分泌引起抑制性TIME。针对MMP9重塑TIME并增强CTNNB1GOF HCC中抗PD-1的疗效。
该研究于2023年12月发表在《Gut》，IF：24.5。
技术路线：
结果:
1、MMP9 在 CTNNB1GOF HCC 中表达上调
为了识别由CTNNB1GOF驱动的激活基因，我们通过流体动力学尾静脉注射（HTVi）激活的AKT/β-连环蛋白、c-Met/β-连环蛋白和c-Myc/β-连环蛋白的三种HCC模型构建了具有CTNNB1GOF背景的三种类型。ΔN90-β-连环蛋白质通过HTVi与另一个致癌基因质结合，促使肝脏中的肿瘤发生。然后，使用流式细胞仪（FCM）和t-分布式随机邻域嵌入（t-SNE）分析对肝脏免疫微环境进行了分析。与先前的报告一致，在CTNNB1GOF HCC中，巨噬细胞和骨髓源性抑制性细胞的浸润增加，而DCs、CD8+和CD4+ T细胞减少（图1A–C）。与此同时，CD8+ Granzyme B+ T细胞减少，表明CTLs的细胞毒性受损。由于肿瘤负担较高，实验组的总生存期（OS）缩短。随后，对三对模型进行了RNA-seq。韦恩图显示了3个上调基因（MMP9、PROCR、ZFP287）的重叠（折叠变化（FC）>1.0，p<0.05）（图1D）。为了识别与免疫调节和不良预后相关的核心基因，我们通过在癌症基因组学数据库（TCGA）数据集中使用蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI网络）和单变量COX回归对ImmuneScore和StromalScore筛选的差异表达基因（DEGs）进行了分析。结果，确定了五个基因（CXCL5、MMP9、PLAUR、CLEC5A、ITGB6）（图1E）。这两个基因集的交集确定MMP9是潜在的CTNNB1GOF驱动基因，可能在HCC中重塑TIME。然后，验证了MMP9在CTNNB1GOF肿瘤中高表达（图1F）。
MMP9在多个基因表达均衡数据库中都被证实在HCC中上调。此外，根据Lu的单细胞测序数据，肝细胞中MMP9在HCC进展过程中呈最显著升高（图1G）。此外，我们使用国际癌症基因组学联盟数据集中的21基因特征调查了CTNNB1的活化状态。结果显示，在CTNNB1突变的活跃状态下，MMP9上调（图1H）。MMP9在CTNNB1GOF HCC中的上调也在同济队列中观察到（图1I和J）。与此同时，CTNNB1GOFMMP9高表达的肿瘤与更差的生存和较低的无病生存率相关（图1K）。这些结果表明MMP9在CTNNB1GOF HCC中上调，并与不良预后相关。
2、MMP9通过诱导抑制性的免疫微环境（TIME）促进HCC的进展
基因集富集分析（GSEA）显示MMP9表达与TCGA-LIHC数据集中的抑制性免疫微环境（TIME）相关。MMP9在体外和BALB/c裸鼠的肿瘤增殖中几乎没有影响（图2A）。然而，MMP9的敲低显著减少了C57BL/6 J小鼠的肿瘤体积和重量（图2B）。对两组小鼠脾脏的流式细胞仪（FCM）分析确认，尽管T淋巴细胞的比例相近，但在BALB/c裸鼠中成熟的CD4+和CD8+ T细胞几乎不存在。
接下来，使用MMP9敲低处理的Hepa1-6细胞构建了原位HCC模型，结果显示明显抑制了肿瘤形成并改善了生存（图2C–E）。FCM分析显示MMP9敲低组中总T淋巴细胞、CD8+和CD4+ T细胞增加，而巨噬细胞减少（图2F和G）。同时，CD8+ T细胞中Granzyme B和干扰素γ（IFN-γ）的增加表明CTLs的细胞毒性增强（图2H）。免疫组化（IHC）和多重免疫荧光（mIF）分析进一步证实了这些结果。尽管巨噬细胞的总数减少，但M2表型向M1表型的转变得以观察（图2I）。随后的分析显示CD8+ T细胞中PD-1和T细胞免疫球蛋白和黏液结合域-3（TIM-3）减少（图2J）。此外，使用CD44和CD62L标记CD8+和CD4+ T细胞的结果表明，在MMP9敲低后，免疫记忆反应水平提高（图2J）。总的来说，这些发现表明MMP9通过诱导抑制性的TIME促进了HCC的进展。
3、MMP9 抑制 CD8+ T 细胞的激活和迁移
考虑到在MMP9下调后T淋巴细胞和巨噬细胞极化均发生了变化，我们通过消除CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或巨噬细胞来进一步确定MMP9调控的特定免疫细胞亚群。分别使用抗CD4中和抗CD8中和抗补体进行原位HCC模型处理（图3A）。通过FCM监测清道夫的效果（图3B）。CD8+ T细胞的消耗剥夺了MMP9下调的抑制肿瘤效果，导致更重的肿瘤负担和缩短的生存期（图3C–E）。相反，CD4+ T细胞和巨噬细胞的消耗无法恢复肿瘤生长。这些结果确认了抑制CD8+ T细胞对于MMP9促进肿瘤进展至关重要。
为了揭示MMP9对CD8+ T细胞激活的影响，进行了体外共培养研究。小鼠脾脏CD8+ T细胞受到重组MMP9蛋白的刺激，并与Hepa1-6细胞共培养24小时（图3F）。CD8+ T细胞的肿瘤毒性在MMP9刺激下呈剂量依赖性减弱（图3G）。CD8+ T细胞在MMP9刺激下的细胞培养上清Elisa测定显示，MMP9抑制了肌酸酶B、干扰素γ和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌（图3H）。为了描绘MMP9在CD8+ T细胞迁移中的作用，将肿瘤条件培养基（CM）添加到下层培养皿，并评估CD8+ T细胞向下层培养皿的迁移（图3I）。结果表明MMP9抑制了CD8+ T细胞的趋化作用（图3I）。此外，MMP9不影响CD8+ T细胞的增殖（图3J）。总的来说，这些观察结果表明MMP9阻碍了CD8+ T细胞的激活和迁移，导致了抑制性的免疫微环境。
4、MMP9 阻断可改善 CTNNB1GOF HCC 中的 TIME 并增强抗 PD-1 功效
基于抗PD-1的免疫疗法已广泛用于HCC治疗，并且已报道肿瘤浸润的CD8+ T细胞是抗PD-1疗法的生物标志物。鉴于MMP9对CD8+ T细胞的影响，我们推测MMP9的阻断可能增强抗PD-1疗法的疗效。
为了评估MMP9阻断对CTNNB1GOF HCC中抗PD-1疗效的影响，我们在MMP9肝细胞条件敲除小鼠（MMP9F/F; MMP9-Alb-cre，以下简称MMP9Δhep）中构建了CTNNB1GOF自发性肿瘤模型。在肿瘤形成后，一部分小鼠接受了抗PD-1抗体治疗（图4A）。通过肝形态学、H&E染色和免疫组织化学（IHC）的验证，所有小鼠均被确定为携带CTNNB1GOF的HCC模型（图4B）。值得注意的是，与其他组相比，接受抗PD-1抗体治疗的MMP9Δhep小鼠显示出显著的肿瘤抑制和生存延长（图4C，F）。流式细胞仪分析显示，与其他组相比，接受抗PD-1治疗的MMP9Δhep小鼠CD8+细胞显著增加（图4D）。CD8+ T细胞中Granzyme B和IFN-γ的增加表明CTLs的细胞毒性增强（图4E）。此外，联合治疗组的多器官未观察到病变，表明MMP9阻断和抗PD1的联合治疗总体上是安全的。血常规和血生化分析显示，联合治疗有效缓解了肿瘤负担引起的肝脏和肾脏损伤。
我们进一步引入了MMP-9-in-1，一种特异的MMP9抑制剂，选择性靶向血浆蛋白饱和度（PEX）。类似地，MMP-9-in-1与抗PD-1联合治疗CTNNB1GOF HCC模型（图4G）。一致地，与MMP-9-in-1或抗PD-1单独治疗相比，联合治疗导致更为显著的肿瘤回归和生存延长（图4H1和L）。流式细胞仪分析显示，联合治疗增强了CD8+ T细胞的浸润和细胞毒性（图4J和K）。联合治疗的安全性也通过相同的方式得到验证。
这些结果表明，MMP9阻断有潜力重塑CTNNB1GOF HCC的免疫微环境，并增强对抗PD-1治疗的敏感性。
5、β-连环蛋白介导的 SIRT2 抑制通过促进 β-连环蛋白/KDM4D 复合物的形成上调 MMP9
我们进一步研究了β-catenin调控MMP9的精确机制。在组装转录复合物之前，β-catenin与各种蛋白相互作用形成不同的蛋白复合物，执行不同的功能。据报道，KDM4D与β-catenin相互作用，导致MMP9启动子上H3K9me3的去甲基化。SIRT2可以直接与β-catenin相互作用，抑制Wnt信号输出，而抑制Wnt/β-catenin信号增强SIRT2启动子活性。我们发现XAV939通过激活Wnt/β-catenin信号途径促进了KDM4D的表达，并以剂量依赖和时间依赖的方式抑制了SIRT2的表达（图5A，B）。共免疫沉淀（CoIP）结果验证了β-catenin与KDM4D或SIRT2的结合（图5C，D）。免疫荧光证实了在Hepa1-6细胞的细胞质和细胞核中β-catenin与KDM4D或SIRT2的共定位（图5E）。
基于以上观察，我们假设SIRT2和KDM4D可能与β-catenin竞争结合。CoIP结果表明，SIRT2的过表达显著抑制了β-catenin与KDM4D的结合（图5F，G）。此外，在KDM4D过表达的Hepa1-6细胞中，SIRT2的过表达限制了MMP9的上调（图5H）。随后，通过KDM4D敲除或SIRT2过表达诱导的MMP9蛋白的下调在laduviglusib的刺激下被逆转（图5I，J）。此外，KDM4D敲除或SIRT2过表达抑制了MMP9的表达，并导致TIME的激活，从而抑制了肿瘤的形成（图5K–M）。这些结果表明，通过β-catenin抑制SIRT2促进了β-catenin/KDM4D复合物的形成，从而通过上调MMP9促使抑制性TIME的形成。
6、MMP9 抑制 CTNNB1GOF HCC 中 CD8+ CXCR3+ T 细胞的浸润
接下来，我们进行了scRNA-seq以探讨MMP9在重塑TIME方面的机制。利用荧光激活细胞分选（FACS）从MMP9F/F和MMP9Δhep小鼠的CTNNB1GOF HCC组织中分离肿瘤CD45+细胞。对总CD45+细胞群体的无监督统一流形逼近和投影（UMAP）分析确定了23个亚群（图6A）。所确定的免疫细胞群体包括T细胞、髓样细胞、NK细胞、B细胞、DCs和中性粒细胞。所有细胞都表达高水平的家庭基因ACTB，而免疫细胞是PTPRC+，AFP，表明我们的数据的准确性。这些细胞亚型在MMP9F/F和MMP9Δhep小鼠中是共享的（图6A）。鉴于髓样细胞的大比例，我们进行了单独的分析以确定髓样和非髓样细胞的比例（图6B）。
在先前建立了MMP9在促进CD8+ T细胞依赖性HCC中的作用后，我们对CD8+ T细胞进行了无监督聚类分析。结果揭示了六个不同的CD8+ T细胞亚型，即CD8 MKI67、CD8 CCR7、CD8 GZMM、CD8 CXCR3、CD8 PDCD1和CD8 ITGA4（图6C）。特别是，MMP9Δhep样本显示了CD8 CXCR3细胞的最显著增加（图6D）。我们观察到CD8 CXCR3细胞的转录谱与已报道的与效应T细胞功能相关的CD8 CX3CR1细胞一致。随后，我们研究了CD8+ T细胞的动态免疫状态。伪时间分析显示，过渡过程始于CD8 CCR7细胞，通过以CD8 GZMM和CD8 CXCR3细胞为特征的中间细胞毒状态，最终导致以CD8 PDCD1和CD8 ITGA4细胞为特征的增殖（CD8 MKI67细胞）或衰竭（图6E）。为了进一步描绘过渡状态，我们分别分析了来自MMP9F/F和MMP9Δhep样本的CD8+ T细胞的轨迹。令人惊讶的是，CD8 CXCR3细胞主要分布在MMP9Δhep样本中（图6F，G）。因此，我们得出结论，MMP9敲除主要影响CD8+ CXCR3+ T细胞的浸润和功能。这一结果得到了mIF染色实验的进一步支持，确认了MMP9Δhep样本中CD8+CXCR3+ T细胞的富集（图6H）。基因本体论（GO）和基因组的京都百科全书（KEGG）通路富集分析表明，CD8+CXCR3+ T细胞特异地富集于G蛋白偶联趋化因子受体活性、调节T细胞激活、白细胞迁移和细胞黏附等方面（图6I）。
7、MMP9 通过蛋白水解 SSH1 从 CD8+ T 细胞中脱落抑制 CXCR3 介导的 GPCR 细胞内信号传导
我们假设MMP9介导了对CD8+ T细胞表面蛋白的裂解，从而抑制了GPCR介导的CXCR3内部信号传导。蛋白质组学鉴定了在MMP9刺激后CD8+ T细胞中下调的26种蛋白质（图7A），这些蛋白质富集于GTP酶活性、GDP磷酸酶活性、调节细胞质钙离子浓度和细胞迁移等过程（图7B）。GSEA进一步证明MMP9刺激与多种膜转运过程相关联（图7C）。同样，MMP9抑制了CD8+ T细胞中CXCR3介导的ERK和AKT的磷酸化（图7D）。与未受MMP9刺激的T细胞相比，受MMP9刺激的CD8+ T细胞的F-actin分散在细胞外缘，而在T细胞的前缘积聚（图7E）。这些数据表明MMP9抑制了GPCR的CXCR3介导的内部信号传导。此外，在MMP9刺激下，促进定向细胞迁移和T细胞对抗原刺激的SSH1在CD8+ T细胞中显著降低（图7A，D）。 MMP9和SSH1之间观察到的负相关提示了MMP9在SSH1裂解中的潜在作用。
进一步研究了SSH1在CD8+ T细胞中的作用。CoIP和免疫荧光染色表明SSH1可以与CXCR3结合，但在MMP9介导的SSH1裂解时解离（图7F，G）。在CXCL10刺激下，CD8+ T细胞中SSH1的敲除抑制了ERK和AKT的磷酸化刺激（图7H），并阻碍了CD8+ T细胞的激活、迁移和极化（图7I–L）。此外，SSH1的上调消除了MMP9诱导的CD8+ T细胞迁移和激活的抑制作用。总体而言，这些发现表明MMP9通过裂解CD8+ T细胞表面的SSH1来阻碍GPCR的CXCR3介导的内部信号传导。
8、MMP9 为 HCC 免疫治疗提供了有价值的治疗靶点和生物标志物
这些研究启发我们提出通过靶向MMP9来开发新的治疗方法。开发了一种新的抗MMP9兔单克隆抗体（mAb），并评估了其在临床实践中的潜在治疗价值。无论是抗PD-1还是抗MMP9单药疗法都在一定程度上抑制了肿瘤生长（图8A），而联合治疗则更显著地抑制了肿瘤生长并延长了生存（图8A和B）。流式细胞仪分析显示联合治疗增强了CD8+ T细胞的浸润和细胞毒性（图8C）。此外，在治疗组中没有观察到明显的毒性，确保了抗MMP9 mAb的安全性。总的来说，这些结果显示了抗MMP9 mAb的治疗价值，抗MMP9和抗PD-1的联合可能是HCC免疫治疗的有前景的策略。
在临床上，我们通过肝切除术或活检从同济医院收集了原发性HCC标本进行进一步的分析。在接受术后抗PD-1辅助治疗的队列中（n=38），免疫组化染色结果显示，MMP9表达与β-连环蛋白和KDM4D呈正相关，而与SIRT2呈负相关（图8D）。tSNE分析显示，MMP9水平较高的患者肿瘤内CD8+CXCR3+T细胞浸润减少，CD8+T细胞细胞毒性减弱（图8E）。此外，MMP9表达水平较高的患者术后复发的可能性较大，与MMP9水平较低的患者相比（图8F）。类似地，对于接受抗PD-1新辅助治疗的患者（n=40），MMP9水平较高导致抑制性TIME和对抗PD-1治疗的响应率较低（图8G–K）。
实验方法：
流式细胞术、tSNE、RNA-seq、scRNA-seq、免疫印迹、免疫共沉淀、RT-PCR、双荧光素酶报告测定、免疫组织化学、多重免疫荧光染色、构建质粒、慢病毒转导、细胞毒性测定、Transwell、F-肌动蛋白染色、串联质量标签 (TMT) 标记的蛋白质组学。
参考文献：
Cai N, Cheng K, Ma Y, et al. Targeting MMP9 in CTNNB1 mutant hepatocellular carcinoma restores CD8+ T cell-mediated antitumour immunity and improves anti-PD-1 efficacy. Gut.