EGFR激活肌成纤维细胞促进胰腺癌转移
胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC）是一种高度侵袭性和难治性疾病，预后很差。癌症相关成纤维细胞（Cancer-associated Fibroblasts，CAFs）是公认的潜在治疗靶点，但对异质性细胞群的了解不足限制了治疗。本研究表明肌成纤维细胞（myofibroblastic CAFs，myCAFs）中转化生长因子β（Transforming Growth Factor Beta，TGF-β）通过双调蛋白介导的自分泌过程诱导EGFR/ERBB2信号的传导。在PDAC类器官衍生培养物和小鼠模型中抑制EGFR/ERBB2信号对不同CAF亚型的影响不同，为其异质性的机制提供了见解。值得注意的是，EGFR激活的myCAFs促进小鼠PDAC转移，揭示了myCAF异质性中的功能意义。最后，对其他癌症数据集的分析表明，这些过程可能在其他恶性肿瘤中起作用这些数据为myCAF异质性提供了功能相关性，并确定了PDAC中预防肿瘤侵袭的候选靶点。
该研究于2023年12月28日发表在《Cancer Cell》，IF：50.3。
技术路线
主要研究结果
1. TGF-β和PDAC类器官条件培养基激活myCAFs中的EGFR/ERBB2信号传导
TGF-β信号传导促进PDAC myCAFs的形成和增殖，但尚不清楚该途径是否在这些细胞中发挥其他功能。因此，作者描述了PDAC CAF前体细胞——胰腺星状细胞（Pancreatic Stellate Cells，PSCs）——TGF-β处理后受体酪氨酸激酶（RTK）的磷酸化。磷酸化表皮生长因子受体（p-EGFR）和磷酸化Erb-B2受体（p-ERBB2）是TGF-β处理后激活的最丰富的RTK，与对照培养基中培养的静止PSCs相比，它们的水平显著增加（图1A和1B）。此外，单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集的分析证实了EGFR和ERBB2在小鼠和人中PDAC CAFs的表达。PSC中TGF-β受体II（TGFBR2）的缺失阻断了TGF-β应答基因的诱导、TGF-β依赖性增生和EGFR的激活。这表明TGF-β通过其同源受体TGFBR2激活EGFR。此外，PSC中EGFR和ERBB2的激活快速且持续抑制TGF-β受体I（TGFBR1）（TGFBR1i）（图1C-E）。由于TGF-β治疗4天后仍观察到持续的EGFR/ERBB2激活，作者在该时间点对TGF-β-处理的PSCs和对照进行RNA-seq。TGF-β处理的PSCs富集了已知的myCAF相关途径，包括细胞外基质（ECM）相关、TGF-β-依赖性LRRC15+CAF和iCAF特征（图1F、1G）。这些结果验证了TGF-β处理的PSCs myCAFs中激活的信号通路。此外，该分析显示TGF-β诱导的myCAFs中胆固醇生成相关特征显著富集（图1G）。此外，TGF-β处理PSCs还诱导了与EGFR激活相关的特征，包括KRAS信号传导、MAPK信号传导和Dusp6（ERK通路的已知靶点）表达增加（图1F和1G）。
在体外和体内，PDAC恶性细胞均表达TGF-β。此外，PDAC类器官条件培养基（CM）可激活PSC中TGF-β通路的下游成员SMAD2，而在CM处理的PSC中，抑制TGF-β信号传导可增强iCAF表型。这些结果表明，PDAC类器官CM治疗PSC可激活myCAF。因此，在PDAC类器官分泌TGF-β基础上，评估了PDAC类器官CM是否激活PSC中的EGFR/ERBB2信号传导。PDAC类器官CM诱导PSC中的EGFR和ERBB2激活，这被EGFR和ERBB2受体双重抑制剂（ERBBi）内拉替尼阻断（图2A）。除了TGF-β，PDAC类器官还表达EGFR/ERBB2配体，这可能有助于促进myCAFF中EGFR/ERBB2的激活。为了更好地表征EGFR/ERBB2激活的CAFs，作者在存在或不存在ERBBi的情况下对CM处理的PSCs进行RNA-seq。通过将TGF-β和CM诱导的基因与EGFR/ERBB2抑制下调的基因交叉，发现了体外myCAF衍生的52个基因的ERBB特征（图2B）。CM处理的PSCs上调了KRAS信号传导和Dusp6表达，这些效应被ERBBi阻断，而没有显著改变TGF-β信号传导激活（图2C、2D）。此外，胆固醇b生成相关特征是myCAF衍生的ERBB特征中最显著丰富的途径之一（图2C和2D）。
总之，这些数据支持PDAC恶性细胞分泌的TGF-β激活小鼠和人PDAC中myCAFs中EGFR信号传导。
图1：TGF-β激活myCAFs中EGFR/ERBB2信号传导
图2：myCAFs中TGF-β诱导的自分泌双调蛋白激活EGFR信号
2.TGF-β诱导的自分泌双调蛋白激活myCAFs中的EGFR信号传导
在TGF-β处理30分钟后，PSCs中EGFR信号的早期激活似乎是由增加的受体介导的（图1D）。为了研究TGF-β诱导的myCAFs中EGFR的激活如何持续，作者在RNA-seq图谱中寻找TGF-β或PDAC类器官CM培养的PSCs，ERBBi存在或不存在时EGFR/ERBB2配体表达。图谱确定了EGFR/ERBB2配体，包括TGF-β显著诱导的双调节蛋白（Areg）和肝素结合EGF-样生长因子（Hbegf）（图2E）。RT-qPCR分析证实了TGF-β-诱导的PSC中Areg和Hbegf的表达，Tgfbr2 KO或TGFBR1抑制剂（TGFBR1i）A83-01治疗阻止Areg的表达（图2F和S2D）。此外，在Egfr或Erbb2缺失或药理抑制后，Areg和Hbegf表达部分缺失，这表明了Areg和Hbegf作为体外TGF-β诱导的myCAFs中EGFR激活的候选介质（图2F）。然而，Areg是TGF-β和PDAC类器官CM治疗显著诱导的EGFR/ERBB2唯一配体（图2E）。此外，PSC中TGF-β上调AREG蛋白，Tgfbr2缺失或TGFBR1药物抑制完全阻断AREG蛋白，但Egfr或Erbb2缺失或抑制并不能阻断AREG蛋白（图2G）。在TGF-β诱导的myCAFs中，直接测试了AREG是否介导EGFR信号的激活，PSCs中删除Areg基因（图2H）。与对照组相比，AREG诱导的EGFR持续激活在AREG KO PSCs中减少（图2I）。
因此，PDAC myCAFs中，自分泌AREG介导EGFR激活下游的TGF-β信号
3. 体外抑制EGFR/ERBB2信号转导耗尽myCAFs
为了进一步了解EGFR/ERBB2激活如何影响myCAFs，首先测量了立即或延迟（72小时）暴露于ERBBi后PSC的增殖，发现增殖显著减少，而凋亡没有增加，这表明EGFR/ERBB2信号传导介导了TGF-β-诱导的myCAFs的增殖（图3A、3B）。此外，体外和体内iCAF的缺氧特征在EGFR/ERBB2抑制后增加，相反的，EGFR/ERBB2抑制下调已知的myCAF相关特征（图3C）。RT-qPCR分析证实了EGFR/ERBB2抑制后iCAF标记的上调（图3D）。当PSCs和PDAC类器官在transwell中共培养时，即使PDAC类器官增殖通过ERBBi治疗而减少（图3E），也观察到这种效果。
为了分析更接近体内情况的模型，建立了PDAC类器官与Egfr WT或Egfr KO PSC的共培养物。然后通过RNA-seq分析流动排序的恶性细胞和PSC群体（图3F和3G）。与对照相比，Egfr耗竭时PSC中大多数下调通路由已知的myCAF相关特征构成（图3H；表S3）。虽然缺氧和体外iCAF特征也被下调，但这可能是由于共培养的恶性细胞的变化，而不是Egfr损失的直接影响。
总而言之，这些数据表明EGFR/ERBB2抑制优先针对体外的myCAFs，且只有myCAFs的亚群被耗尽。此外，这些分析突出显示如何联合EGFR/ERBB2抑制，而不是EGFR封锁单独，可能需要体内有效靶向EGFR激活的myCAFs。
图3：体外抑制EGFR/ERBB2信号转导耗尽myCAFs
4. 抑制EGFR/ERBB2信号优先靶向体内myCAFs
为了确定EGFR/ERBB2信号抑制是否差异影响体内不同的CAF亚型，作者用PDAC类器官建立了原位移植小鼠模型，并用EGFR/ERBB2抑制剂（ERBBi）neratinib治疗荷瘤小鼠2周（图4A）。尽管ERBBi治疗后apCAFs没有显著改变，但myCAFs减少，iCAFs增加，PDAC肿瘤中myCAF/非myCAF的比例显著改变（图4B、4C）。虽然已被证明药物抑制时对CAFs形成途径的相互转换，但这是否与本研究相关仍有待确定。为了进一步研究EGFR/ERBB2抑制对CAFs的影响，作者建立了另外的PDAC类器官来源的原位移植小鼠模型，并在流式分选恶性细胞和成纤维细胞群体进行RNA-seq分析之前，用ERBBi或载体治疗荷瘤小鼠2周（图4A和4D）。与EGFR/ERBB2激活发生在myCAFs中的发现一致，与载体治疗肿瘤的CAFs相比，来自ERBBi治疗肿瘤的CAFs显著下调了Areg表达和TGF-β诱导的myCAF特征，并显著上调了体内iCAF特征（图4E）。此外，先前确定的myCAF亚群如TGF-β依赖性LRRC15+CAFs的特征不受ERBBi治疗的影响，表明EGFR/ERBB2抑制可能只会耗尽myCAFs的一个子集。
为了验证上述发现并进一步研究EGFR/ERBB2抑制后CAF群体的变化，作者对用ERBBi或载体治疗2周的PDAC肿瘤进行了单核RNA测序（snRNA-seq）（图4A、4F、4G）。Dusp6表达的下调证实了多种细胞类型中对该通路的靶向作用，DEGs分析确定上皮细胞和CAFs是EGFR/ERBB2抑制后受影响最大的细胞群体（图4H）。与载体治疗的肿瘤相比，ERBBi治疗的PDAC肿瘤中iCAF丰度和iCAF相关特征丰富，而myCAF丰度和myCAF相关特征下调（图4I-4L）。最后，虽然原发性肿瘤生长和腹水和肝转移的发生率没有显著影响，但EGFR/ERBB2抑制导致膈肌和肺转移的小鼠明显减少（图4M）。
总之，这些数据表明体内PDAC抑制EGFR/ERBB2靶向myCAFs，并表明在myCAFs的一个亚群中的EGFR/ERBB2通路抑制可能会损害PDAC转移形成。
图4：体内抑制EGFR/ERBB2信号优先靶向myCAFs
5. 抑制EGFR/ERBB2信号转导耗尽myCAFs的亚群
虽然数据表明EGFR激活的myCAFs在PDAC中具有潜在的转移促进作用，但有文献表明，α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）阳性或HH激活的肌成纤维细胞和细胞外基质成分（如胶原）抑制PDAC进展。与些先前研究以及TGF-β3或HH信号传导抑制相比，ERBBi治疗并未减少整体胶原沉积或肌成纤维细胞标志物αSMA的水平（图5A-5C）。因此，作者评估了EGFR/ERBB2抑制是否仅针对PDAC肿瘤中myCAFs的一个亚群。作者之前研究发现Thy1（编码CD90）在myCAFs中高度表达。为了调查ERBBi治疗对myCAFs子集的潜在差异影响，作者评估了CD90-或CD90+myCAFs（如CD31-CD45-EpCAM-PDPN+Ly6C-MHCII-）丰度的变化。发消息，EGFR/ERBB2抑制对myCAFs的消耗仅限于CD90−myCAFs，在CD90+myCAFs中有适度增加（图5D）。
为了更好地表征CD90- 和CD90+myCAF群体，建立了PDAC的原位嫁接类器官衍生小鼠模型，并在RNA-seq之前对两个myCAF群体进行了流动排序（图5E、5F）。RNA-seq分析证实了两个myCAF群体的流动排序，显示与CD90+ myCAFs相比，CD90-myCAFs中Thy1表达显著下调（图5G）。与CD90+ myCAFs相比，CD90- myCAFs具有显着更高水平的Areg和Dusp6，这表明EGFR信号在CD90- myCAF亚群中更高（图5G）。这些数据为EGFR/ERBB2抑制优先靶向CD90- myCAFs提供了解释。此外，与CD90- myCAFs相比，CD90+ myCAFs具有明显更高的Acta2和Col1a1表达，并且ECM相关特征富集（图5H和5I）。因此，上述数据表明，由于靶向产生较少ECM的CD90-myCAF亚群，EGFR/ERBB2抑制后胶原沉积和αSMA水平没有改变。此外，CD90-myCAFs显著富集胆固醇生物合成相关特征，这些特征在体外TGF-β诱导的myCAF和myCAF-衍生的ERBB特征中上调（图5I、1G和2C）。此外，CD90- myCAFs显示出已知体内iCAF和myCAF特征的显著下调，证实了它们与CD90+myCAFs或其他先前描述的myCAF，包括TGF-β依赖性LRRC15+myCAFs的表型差异（图5I）。最后，除了Areg，还发现了许多在CD90−和CD90+myCAFs中差异表达的其他分泌蛋白，它们可能介导这些CAF群体的不同功能。具体来说，CD90+myCAFs富含胶原蛋白，已被证明在PDAC中起到肿瘤抑制作用，而CD90-myCAFs上调了编码分泌蛋白的基因，包括Spp1和Sema3e，这些蛋白已被证明促进转移（图5J）。
总的来说，这些数据提供了对myCAF异质性的见解，并确定了依赖于EGFR/ERBB2信号激活并可能影响PDAC进展的myCAF亚群。
图5：抑制EGFR/ERBB2信号转导耗尽myCAFs亚群
6. EGFR激活的myCAFs促进PDAC转移
在小鼠模型中的ERBBi研究表明，myCAFs中的EGFR/ERBB2抑制可能会损害PDAC转移的形成（图4M）。然而，已有研究报道过PDAC肿瘤中恶性细胞的EGFR信号传导，snRNA-seq分析确定上皮细胞是ERBBi治疗后PDAC肿瘤中受影响最大的细胞类型（图4H）。因此，为了研究EGFR激活的myCAFs在PDAC进展中的作用，建立了PDAC类器官单独或与Egfr WT（如Rosa26 KO）或Egfr KO PSCs共同注射的原位移植小鼠模型（图6A）。通过IHC检测与SV40大T抗原永生的共移植PSC，证实EGFR信号在促进CAF增殖。作者评估了CAFs中Egfr缺失后的改变是否与EGFR/ERBB2抑制后观察到的一致，与PDAC+Egfr WT PSC肿瘤相比，PDAC+Egfr KO PSC肿瘤含有更少的myCAFs，更多的iCAFs（图6B和图6C）。值得注意的是，来自PDAC+Egfr WT PSC的肿瘤明显大于单独来自PDAC的肿瘤（图6D）。此外，与EGFR/ERBB2抑制后观察到的相似，它们产生的隔膜转移、肺转移和腹水明显多于单独PDAC或PDAC+Egfr KO PSC肿瘤（图6E-6I）。
为了研究CAFs中的AREG阻断是否会重现EGFR信号完全消融的影响，建立了PDAC类器官单独或与Areg WT（即Rosa26 KO）或Areg KO PSC（图6J和S6I）共同注射的原位移植小鼠模型。与PDAC+Areg WT PSC肿瘤相比，PDAC+Areg KO PSC肿瘤的巨噬细胞明显减少（图S6J和S6K）。这些发现与体外分析一致，显示Egfr缺失下调但不完全确实PSC中Areg的表达（图2F和2G），并表明myCAF产生的AREG在成纤维细胞-巨噬细胞串扰中的作用。此外，PDAC+Areg KO PSC肿瘤在整体CAF丰度或iCAF/myCAF比例方面与PDAC相比没有显著差异，这些结果表明Areg缺失损害但不完全抑制EGFR信号激活，和myCAF形成（图2I）。PDAC+Areg WT PSC肿瘤明显大于单独来自PDAC或PDAC+Areg KO PSC的肿瘤（图6K）。这些发现也符合体外分析，显示Egfr缺失并不完全降低PSC中Areg的表达，并表明myCAF产生的AREG在局部起作用以促进原发PDAC生长。最后，PSC中的Areg缺失损害了膈肌转移、肝转移和腹水的形成，但对肺转移没有影响，进一步突出了CAF介导的PDAC转移过程的复杂性（图6L-6N）。
总之，这些数据确定了以前未被认识到的myCAFs的功能复杂性，表明EGFR激活的myCAFs促进PDAC的转移。此外，这些结果表明，为了更有效地损害其促转移作用，需要完全消融CAFs中的EGFR信号激活，而不是单独阻断AREG。
图6：EGFR激活myCAFs促进PDAC转移
7. EGFR激活的myCAFs促进PDAC恶性细胞的转移潜能
为了研究EGFR激活的CAFs促进PDAC转移的潜在机制，对与Egfr WT或Egfr KO PSCs共培养的PDAC类器官中流式分选的RNA-seq进行分析（图3F和3G）。结果看出与Egfr缺失的PSCs培养的类器官中，参与转移形成的通路显著下调，包括EMT转换和缺氧基因特征（图7A）。为了调查这些变化是否也在体内观察到，建立了PDAC类器官与Egfr WT（即Rosa26 KO）或Egfr KO PSCs共注射的原位移植小鼠模型，并对流式分选的恶性细胞进行RNA-seq（图7B和7C）。与PDAC+Egfr WT PSC肿瘤流式分选的恶性细胞相比，DAC+Egfr KO PSC分选出的恶性细胞显示EMT特征下调（图7D）。还分析了体内EGFR/ERBB2抑制后恶性细胞转录组的变化，发现EGFR激活的myCAFs耗尽。ERBBi-或载体治疗2周后，PDAC肿瘤通过流式分选恶性细胞的RNA-seq证实了ERBBi治疗后转移相关通路下调，包括EMT和缺氧基因特征（图4A、4D和7E）。这些结果也通过ERBBi-或载体治疗2周的肿瘤中PDAC恶性细胞的snRNA-seq分析得到证实，该分析显示，与载体治疗的肿瘤相比，ERBBi治疗的肿瘤上皮细胞中EMT和缺氧基因特征显著下调（图4A、4F-4H）。
总之，这些数据支持EGFR激活myCAFs通过增强PDAC恶性细胞的转移潜力促进PDAC转移形成（图7G）。
图7：EGFR激活myCAFs促进PDAC恶性细胞的转移潜能
结论
通过互补的体外和体内分析，作者揭示了EGFR激活在PDAC CAFs中以前未知的作用。数据显示TGF-β诱导PDAC myCAFs中的AREG表达，引发自分泌EGFR/ERBB2反应。该网络似乎微调了CAF细胞状态的平衡，相对于iCAF表型，更有利于myCAF。因此，EGFR/ERBB2抑制优先针对myCAFs而不是iCAFs。此外，体内这种效应似乎仅限于EGFR信号激活更高的CD90-myCAFs亚群。最后证明了EGFR激活的myCAFs促进小鼠PDAC转移，从而揭示了双向恶性细胞-成纤维细胞串扰调节PDAC myCAF分子和功能异质性并驱动转移的机制。
实验方法
细胞培养和处理，小鼠实验，原位移植小鼠模型，蛋白质印迹分析，ELISA检测，扩散分析，免疫组织化学和组织学分析，RNA原位杂交分析，流式细胞术分析，细胞共培养，流式分选，逆转录定量聚合酶链反应分析，RNA测序和单细胞RNA测序分析，基因集变异分析，单核RNA测序，降维和聚类，差异基因表达(DEG)分析，基因集富集分析
参考文献
Mucciolo Gianluca, Araos Henríquez Joaquín, Jihad Muntadher, et al. EGFR-activated myofibroblasts promote metastasis of pancreatic cancer.[J] .Cancer Cell, 2023, undefined: undefined.