高2,6-唾液酰化促进CD4+ t细胞活化并诱导溃疡性结肠炎的发生

2,6-唾液酰化，由2,6-唾液酰转移酶(ST6GAL1)催化，在免疫应答中起关键作用。然而，ST6GAL1在溃疡性结肠炎(UC)发病机制中的作用尚不清楚。ST6GAL1 mRNA在UC组织中较相应的邻近正常组织高表达，并且在UC患者结肠组织中2,6-唾液酰化显著升高。ST6GAL1和促炎细胞因子如白细胞介素(IL)-2、IL-6、IL-17和干扰素- γ的表达也增加。UC患者CD4+ T细胞数量增加。ST6GAL1基因敲除(ST6GAL1−/-)大鼠是通过CRISPR建立的。缺乏ST6GAL1可降低UC模型大鼠的促炎细胞因子水平，减轻结肠炎症状。2,6-唾液化的消融抑制TCR向脂质筏的转运并抑制CD4+ t细胞的活化。TCR信号的衰减可下调ST6GAL1-/- CD4+ t细胞中NF-B的表达。此外，NF-B可以结合ST6GAL1启动子来增加其转录。ST6GAL1的消融术可下调NF-B的表达，减少促炎细胞因子的产生，缓解UC的发病机制，是UC临床治疗的潜在新靶点。该文于2023年9月发布于《Advanced Science》, IF=15.1。

技术路线：

主要研究结果：

1、2,6-唾液酰化在UC中高表达

不同种类的n -聚糖由几种糖苷酶和糖基转移酶催化。最重要的“封顶”反应包括通过STs将唾液酸添加到分支上。为了探讨唾液酰化与UC发生的相关性，作者使用Gene expression Omnibus (GEO)数据库生物信息学分析分析了UC患者与健康对照(HCs)中ST家族基因的表达(图1B)。在GSE179285数据集中，与HCs相比，UC患者中有17044个基因发生改变，其中包括8396个上调基因和8348个下调基因(图1C)。在UC患者中，ST6GAL1、ST3GAL1、ST3GAL2、ST3GAL3、ST3GAL4、ST3GAL5、ST6GALNAC4、ST6GALNAC5、ST6GALNAC6、ST8SIA1、ST8SIA4的表达水平显著升高(图1D)。使用GEO2R分析软件对样本间的数据进行归一化方差分析(图1E)。在UC或结肠癌患者中观察到异常的唾液化。作者从UC和HCs患者的结肠组织中分离RNA，比较STs的mRNA水平。与HCs相比，UC患者中ST6GAL1 mRNA表达选择性过表达(图1F)。ST6GAL1催化唾液酸从CMP-Neu5Ac供体转移到半乳糖末端残基，形成2,6-连锁(2,6-唾液酰化)(图1A)。作者用特异性识别2,6-唾液酸结构的黑Sambucus nigra凝集素(SNA)凝集素印迹法检测了2,6-唾液酸原位化水平。2,6-唾液酰化主要在UC患者的结肠组织中升高(图1G)。

图1、2,6-唾液酰化在UC结肠组织中显著升高

2、ST6GAL1消融术缓解大鼠UC症状

鉴于2,6-唾液酰化在UC患者中显著升高，作者研究了ST6GAL1介导的2,6-唾液酰化如何调节UC的发病机制。作者使用CRISPR-Cas9技术改造了ST6GAL1+/−大鼠(图2A)。通过杂合ST6GAL1+/−大鼠杂交获得纯合野生型(ST6GAL1+/+)和敲除型(ST6GAL1−/−)大鼠(图2B)。当ST6GAL1+/−大鼠杂交时，ST6GAL1+/+、ST6GAL1+/-和ST6GAL1−/-大鼠的比例≈1:2:1，符合孟德尔遗传(图2C)。ST6GAL1产物是2,6-唾液化的n -聚糖，通过SNA印迹证实，它在ST6GAL1 +/+血清中普遍表达，但在ST6GAL1−/−血清中不存在(图2D)。在凝集素印迹分析中，Aleuria aurantia lectin (AAL)、Maackia amurensis lectin (MAL)和concanavalin A lectin (ConA)的差异无统计学意义。ST6GAL1基因的消融不影响大鼠的体重(图2E)。为了评估ST6GAL1在UC发生中的作用，作者用5%葡聚糖硫酸钠(DSS)给ST6GAL1 +/+和ST6GAL1−/−大鼠建立了UC模型(图2F)。首先，作者用免疫荧光法检测了大鼠体内2,6-唾液酰化水平。A2,6-唾液酰化在UC小鼠中升高(图2G)。与ST6GAL1+/+大鼠相比，ST6GAL1−/−大鼠在UC模型中表现出明显的体重减轻(图2H)。此外，UC造模后ST6GAL1−/-大鼠出现轻度大便不规则和便血。疾病活动指数(disease activity index, DAI)包括体重、大便形状、便血等因素，常用于评估UC的严重程度。UC模型中，ST6GAL1-/-大鼠DAI评分低于ST6GAL1+/+大鼠(图2I)。此外，UC模型中ST6GAL1+/+大鼠的结肠长度更短，而ST6GAL1−/−大鼠的结肠长度没有变化(图2J)，表明ST6GAL1消融减轻了UC的症状。

图2、消融ST6GAL1可缓解UC大鼠UC症状

3、UC患者CD4+ t细胞中促炎细胞因子表达上调

苏木精-伊红染色(HE)显示UC患者结肠损伤严重(图3A)，病理评分增高(图3B)。此外，作者分离了ST6GAL1+/+和ST6GAL1−/−大鼠的肠上皮细胞，在体外用脂多糖(LPS)刺激肠上皮细胞，并表征了ST6GAL1的mRNA水平。2,LPS刺激后上皮细胞的6-唾液酰化增加。鉴于免疫失衡是UC发病的重要原因之一，作者利用单细胞测序技术和huARdb (https://huarc.net/数据库)对UC患者的免疫细胞数量进行了分析。UC患者CD4+ T、Th1、Th17和Treg细胞数量增加，而Th2细胞数量减少(图3C)。此外，结肠组织中CD4+ T细胞的数量急剧增加(图3D)。基因本体(GO)富集分析也表明，UC患者的CD4+ T细胞和炎症反应富集。UC组织中促炎因子如白细胞介素(IL)−2、IL-6、IL-17a和IFN- 水平显著升高，而抗炎因子IL-4、IL-10和IL-13水平降低(图3E)。接下来，作者测定了UC患者外周血中免疫细胞的数量。UC患者CD4+ T细胞数量显著增高;然而，CD8+ T细胞数量未见变化(图3F)。CD4+CD25+FoxP3+ (Treg)细胞数量减少(图3G)。促炎因子il - 2、IL-6、IL-17水平显著升高，抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13水平降低(图3H)。总体而言，UC患者的促炎细胞因子水平升高，并伴有CD4+ T细胞产生的抗炎细胞因子下调。

图3、UC患者CD4+ t细胞数量和促炎细胞因子表达上调

4、ST6GAL1基因消融术减少UC大鼠CD4+ t细胞产生促炎细胞因子

ST6GAL1−/−UC大鼠UC症状得到缓解，UC患者CD4+ T细胞和促炎细胞因子水平显著升高。这表明ST6GAL1影响CD4+ T细胞数量和细胞因子水平。因此，作者检测了ST6GAL1+/+和ST6GAL1−/−UC大鼠的CD4+ T细胞数量和促炎细胞因子水平。ST6GAL1−/−UC大鼠的病理评分低于ST6GAL1+/+ UC大鼠(图4A,B)。与ST6GAL1−/−UC大鼠相比，ST6GAL1−/−UC大鼠脾脏(图4C)和Peyer’s patches(图4D)中CD4+ T细胞数量减少。此外，与ST6GAL1−/−CD4+ t细胞相比，来自ST6GAL1+/+ UC大鼠的CD4+ t细胞促进了UC的发生。一些研究报道Treg和Th17细胞之间的平衡对维持肠道内稳态很重要。Treg细胞的减少或Th17细胞的增加会促进肠道炎症。ST6GAL1−/−UC大鼠脾脏Treg细胞和Peyer 's斑块数量增加，而Th17细胞数量减少。ST6GAL1−/−CD4+ T细胞中Treg细胞数量增加，而Th17细胞数量减少。此外，ST6GAL1−/−UC大鼠表现出低水平的促炎细胞因子IL-2、IL-6、IL-17a和IFN- 和高水平的抗炎细胞因子IL-4、IL-10和IL-13(图4E)。上述结果表明，ST6GAL1消融可诱导CD4+ T细胞向treg细胞极化，抑制其向Th17细胞极化。

图4、ST6GAL1基因消融术可减少UC模型大鼠CD4+ t细胞产生促炎细胞因子

5、ST6GAL1基因的消融术抑制CD4+ t细胞的增殖和活化

CD4+ T细胞的过度活化与UC的发病机制有关。为了研究ST6GAL1在CD4+ T细胞活化中的作用，作者采用磁珠分选方法从ST6GAL1 +/+和ST6GAL1−/−大鼠脾脏中分离CD4+ T细胞。在羧基荧光素二乙酸琥珀酰酯实验中，ST6GAL1的消融抑制了抗CD3和CD28抗体刺激后的CD4+ t细胞(图5A)。T细胞在激活后经常聚集成簇。与ST6GAL1+/+ CD4+ T细胞相比，激活后ST6GAL1−/- CD4+ T细胞聚集减少(图5B)。流式细胞术还显示，ST6GAL1−/-大鼠体内CD4+CD69+细胞(活化CD4+ T细胞)数量较少(图5C)。为了进一步阐明ST6GAL1调控CD4+ T细胞活化的机制，作者建立了ST6GAL1基因敲低Jurkat细胞(Jurkat- shST6GAL1 cells)， ST6GAL1恢复Jurkat- shST6GAL1 - re细胞。ST6GAL1 mRNA在Jurkat-shST6GAL1细胞中的表达降低，通过将ST6GAL1基因重新导入JurkatshST6GAL1细胞，ST6GAL1 mRNA的表达得以恢复(图5D)。SNA凝集素印迹分析证实ST6GAL1基因表达水平。2,6-唾液化在Jurkat-shST6GAL1细胞中几乎检测不到，但在Jurkat-shST6GAL1- re细胞中恢复。ST6GAL1的缺失导致Jurkat细胞的增殖受到抑制，通过重新引入ST6GAL1, Jurkat细胞的增殖得以恢复(图5E)。Jurkat-shST6GAL1细胞的细胞聚集被抑制，但在Jurkat-shST6GAL1- re细胞中恢复(图5F)。在Jurkat-shST6GAL1细胞中，CD69+细胞的数量被抑制，并通过重新引入ST6GAL1恢复(图5G)。

图5、ST6GAL1基因在体外抑制CD4+ t细胞的增殖和活化

6、ST6GAL1基因的消融抑制t细胞受体(TCR)向脂筏的易位并减弱CD4+ t细胞中TCR信号传导

在对t细胞激活的反应中，TCR与脂质筏相关，脂质筏作为信号传导和运输的平台。作者首先使用质谱法测定了CD4+ T细胞TCR的n -聚糖谱。在TCR中鉴定出含有单、二、三或四半乳糖的唾液化n -聚糖。在ST6GAL1−/- CD4+ t细胞中，TCR上n -聚糖的2,6-唾液酰化被消除。用共聚焦显微镜观察抗CD3/CD28刺激后CD4+ T细胞表面TCR的分布。Flotillin-1是脂筏的标志物，对脂筏的结构和功能有重要影响。ST6GAL1的消融抑制了脂筏的形成，Flotillin -1的低表达证明了这一点(图6A,B)。与ST6GAL1+/+ CD4+ T细胞相比，ST6GAL1−/- CD4+ T细胞中脂筏中TCR的水平降低，重新引入ST6GAL1可以恢复这些影响(图6A)。作者检测了抗CD3 /CD28刺激后的TCR信号通路。ST6GAL1基因的消融抑制了TCR下游的Zap70、p38和细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化(图6C)。NF-B (p65)在ST6GAL1−/- CD4+ t细胞中的表达下调(图6C)。此外，ST6GAL1的缺失抑制了p-p65在CD4+ T细胞中的核易位。NF-B的激活往往会诱导促炎细胞因子的产生，从而诱发UC，因此作者分析了NF-B与ST6GAL1之间的相互作用。染色质免疫沉淀-实时聚合酶链反应(ChIP-qPCR)显示NF-B可以结合ST6GAL1启动子上游的- 129至- 109碱基对(bp)。与ST6GAL1+/+ CD4+ T细胞相比，在ST6GAL1−/- CD4+ T细胞中，NF-B与ST6GAL1的相互作用被抑制(图6D)。为了进一步研究ST6GAL1在T细胞活化过程中的作用，作者使用转录组学分析了ST6GAL1+/+和ST6GAL1−/- CD4+ T细胞中的基因表达。与ST6GAL1+/+ CD4+ T细胞相比，ST6GAL1−/−CD4+ T细胞显示555个下调基因和551个上调基因。氧化石墨烯分析显示，ST6GAL1的缺失抑制CD4+ T细胞激活和炎症反应(图6E)。京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示，ST6GAL1的缺失下调了多个信号分子的表达，如TCR、NFB、IL-17、TNF和PI3K-AKT(图6F)。相反，组织转录组学分析显示，UC患者的TNF、IL-17、NF-B和PI3K-AKT通路增强。这些结果表明，ST6GAL1通过调节TCR、NF-B等信号通路影响CD4+ T细胞的活化。ST6GAL1的缺失抑制了Jurkat-shST6GAL1细胞中TCR的表达和脂质筏的形成，这种抑制可以通过将ST6GAL1重新引入Jurkat-shST6GAL1细胞来恢复。免疫印迹结果与免疫荧光结果一致。在Jurkat-shST6GAL1细胞中，ST6GAL1的缺失抑制了Zap70、p38和ERK的磷酸化，并下调了NF-B的表达，这些变化在Jurkat-shST6GAL1- re细胞中得以恢复。CHIP-qPCR分析显示，NF-B在Jurkat细胞系和CD4+ T细胞中与ST6GAL1启动子上游区域的- 129至- 109 bp位置结合。作者通过转录组学分析分析ST6GAL1基因对Jurkat细胞基因表达谱的影响。与Jurkatshctl细胞相比，850个基因表达上调，1590个基因表达下调。氧化石墨烯分析显示，ST6GAL1基因敲低可降低T细胞活化、细胞表面受体信号传导、炎症反应和其他生物学功能KEGG分析显示，ST6GAL1基因沉默降低了TCR、TNF-、IL-17、细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)和其他信号通路。

图6、ST6GAL1基因的消融可抑制TCR向脂筏的易位，并减弱CD4+ t细胞中的TCR信号传导

7、ST6GAL1与NF-B在UC发病中呈正相关

为了研究ST6GAL1与NF-B在UC发病机制中的相关性，作者检索了GEO数据库中GSE179285的数据。UC患者结肠中ST6GAL1和NF-B的表达水平较HCs升高(图7A)。Spearman相关分析显示，UC和HCs患者中ST6GAL1与NF-B呈正相关。为了进一步验证NF-B与ST6GAL1的相关性，作者采用RT-qPCR检测了13名健康志愿者和14名UC患者结肠组织中NF-B和ST6GAL1的mRNA水平。UC组NF-B和ST6GAL1的表达明显升高(图7B)，二者表达呈正相关(图7C、D)。作者使用双荧光素酶报告试验进一步验证了ST6GAL1和NF-B之间的相互作用。NF-B结合到ST6GAL1基因的启动子区域并启动转录，导致荧光素酶活性显著增加(图7E)，表明NF-B与ST6GAL1基因表达呈强正相关。此外，NF-B和ST6GAL1的表达与UC的严重程度呈正相关(图7F,G)，这表明NF-B和ST6GAL1抑制剂的开发可能有助于治疗UC。

图7、ST6GAL1在UC发病过程中与NF-B呈正相关

结论

T细胞活化伴随着糖基转移酶、糖苷酶及其底物的差异表达，这些差异在调节t细胞应答中起着直接而有力的作用。ST6GAL1缺乏可抑制TCR的2,6-唾液化，抑制TCR进入CD4+ t细胞脂筏，减弱TCR信号强度，进一步下调NF-B的表达，减少促炎细胞因子的产生，减轻UC。ST6GAL1可调节多种糖蛋白的生物学功能;因此，2,6-唾液化蛋白的广泛变化使得很难确定ST6GAL1在单个糖基化蛋白激活T细胞中的作用。然而，我们的观察结果显示UC的发病机制部分负责与CD4+ T细胞中ST6GAL1高表达相关的功能改变，这是UC临床治疗的潜在新靶点。

实验方法

CRISPR-CAS9、慢病毒转染、免疫荧光、流式细胞术、双荧光素酶报告基因测定

参考文献

Fan Q, Li M, Zhao W, Zhang K, Li M, Li W. Hyper α2,6-Sialylation Promotes CD4+ T-Cell Activation and Induces the Occurrence of Ulcerative Colitis. Adv Sci (Weinh). 2023 Sep;10(26):e2302607. doi: 10.1002/advs.202302607. Epub 2023 Jul 9. PMID: 37424034; PMCID: PMC10502867.