组蛋白乳酸化增强的ALKBH3通过m1A去甲基化促进肿瘤进展

         虽然N1 -甲基腺苷（m1A）RNA修饰是RNA代谢的重要调节因子，但m1A修饰在肿瘤发生中的作用仍不清楚。在本研究中，作者发现组蛋白乳酸化通过去除SP100A的m1A甲基化，增强ALKBH3的表达，同时减少肿瘤抑制性早幼粒细胞白血病蛋白（PML）凝集物的形成，促进癌症的恶性转化。在机制上，YTHDF1负责识别m1A甲基化SP100A转录物，从而提高其RNA稳定性和翻译效率。该研究于2023年12月发表在《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》，IF：14.9。

技术路线：

主要研究结果：

1. ALKBH3 在眼部黑色素瘤中的特异性增高与不良预后有关

         为了确定m1A修饰在眼部黑色素瘤发病机制中的作用，首先比较了眼部黑色素瘤样本（3个CoM样本和3个UM样本）和4个对照痣样本的总体m1A修饰水平。值得注意的是，眼黑色素瘤样本的m1A水平明显降低，这一点已通过抗m1A点印迹检测得到证实（图1A和B）。此外，去甲基化酶ALKBH3在肿瘤中的蛋白表达也增加了（图1C-E），这与眼黑色素瘤中m1A水平降低的发现一致。此外，ALKBH3的升高与不良预后有关（图1F），这进一步强调了ALKBH3在眼部黑色素瘤癌变过程中的重要性。一致的是，与正常色素细胞（PIG1）相比，大多数黑色素瘤细胞系（MUM2B、OCM1、OMM2.3、OMM1、MEL290、92.1、CRMM1、CRMM2、CM2005.1）的m1A水平显著下降（图1G和H），ALKBH3水平显著升高（图1I-K）。此外，高通量转录组测序进一步证实了ALKBH3在眼黑色素瘤细胞系中的上调（图1L）。重要的是，在这些细胞中，ALKBH3与m1A水平呈显著负相关，表明上调的ALKBH3是m1A水平降低的原因（图1M）。

图1. 眼部黑色素瘤的ALKBH3表达增加，m1A水平降低，与存活率低有关

2. ALKBH3 在体外和体内加速眼部黑色素瘤的致癌过程

         为了探索 ALKBH3 的致癌功能，使用两种 shRNAs 沉默ALKBH3 的表达（图 2A 和 B）。结果发现，ALKBH3 缺失的细胞中 m1A 水平明显升高（图 2C）。此外，在所有测试的眼黑色素瘤细胞中，ALKBH3沉默导致细胞生长（图2D）和集落形成能力（图2E和F）显著减弱。此外，如 Transwell 试验所示，敲除 ALKBH3 会导致迁移能力下降（图 2G 和 H）。这些数据证明了ALKBH3是眼黑色素瘤体外恶性增殖和转移的必要致癌因子。为了评估它们在体内形成肿瘤的能力，将对照组和ALKBH3沉默的92.1黑色素瘤细胞（荧光素酶标记）注射到裸鼠体内，并在正位异种移植模型中监测肿瘤的生长。生物发光成像显示，ALKBH3缺陷眼黑色素瘤细胞的信号强度比对照细胞弱（图2I）。此外，ALKBH3沉默组的异种移植物平均重量减少了80%（图2J）。总之，这些实验证明了ALKBH3在体外和体内眼黑色素瘤的肿瘤发生过程中起着致癌作用。

图2. 敲除 ALKBH3 可提高 m1A 水平并抑制眼部黑色素瘤的发生

3. 组蛋白乳酸化可促进 ALKBH3 的过度表达

         为了确定ALKBH3表达增加的分子基础，查询TCGA数据库，筛选与ALKBH3表达模式相似的基因。乳酸生成酶LDHA和LDHB与ALKBH3呈显著正相关，表明ALKBH3与乳酸之间存在关联（图3A和B）。然后，验证了眼部黑色素瘤队列中泛乳化和组蛋白乳酸化标记（H3K18la）之间的表达模式，结果显示它们与ALKBH3蛋白的表达呈显著的正相关（图3B和C）。更重要的是，H3K18la的CUT&Tag和ChIP-seq分析都表明，在ALKBH3的启动子区域捕获到了强大的组蛋白乳酸化信号（存于GEO数据库：GSE242019，图3D和E）。此外，组蛋白乳酸化抑制剂（草铵膦酸盐和 2-DG）和 LDHA/B 抑制剂都会导致 ALKBH3 启动子区域的组蛋白乳酸化水平急剧下降（图 3F），进而在所有测试的黑色素瘤细胞中消减 ALKBH3 的 RNA（图 3G）和蛋白水平（图 3H-J）。

图3. 组蛋白乳化可促进 ALKBH3 的表达

4. 多组学筛选确定 SP100A 为 ALKBH3 的下游候选者

         由于ALKBH3负责去除RNA中的m1A修饰，首先对眼部黑色素瘤细胞和正常黑色素细胞进行m1A-MeRIP-seq分析（存于GEO数据库：GSE213748，图4A）。结果，从正常细胞和肿瘤细胞产生的m1A-MeRIP-seq文库中分别鉴定出了平均16 864个和10 212个m1A峰（图4A和B，蓝框）。此外，在沉默 ALKBH3 后，对 92.1 黑色素瘤细胞系进行了一系列全面的高通量筛选，包括 m1A-MeRIP-seq（存入 GEO 数据库：GSE213748，图 4C，棕色框）、RNA-seq（存入 GEO 数据库：GSE213681，图 4D 和 E，绿色框）和蛋白质组分析（iTRAQ，图 4F）： 对 92.1 黑色素瘤细胞系进行蛋白质组分析（iTRAQ，图 4F）。同样，m1A修饰位点的变化明显富集于肿瘤相关通路，包括PI3K-Akt信号转导、病灶粘附和蛋白多糖合成（图4C）。此外，沉默 ALKBH3 导致基因表达水平发生了显著变化，上调基因达 199 个，下调基因达 74 个（图 4D 和 E，存于 GEO 数据库：GSE213681）。同样，蛋白质组水平也发生了巨大的全基因组变化（149个蛋白上调，67个蛋白下调，图4F），进一步强调了ALKBH3在眼部黑色素瘤发病机制中的重要性。

         有趣的是，结合这些多组学数据注意到，在眼黑色素瘤细胞中沉默ALKBH3后，核自身抗原斑点蛋白100（SP100）在mRNA和蛋白质水平上都上调了，而m1A修饰水平也发生了巨大变化（图4G-M）。值得注意的是，SP100 负责 PML 核体的形成，主要作为各种癌症类型的肿瘤发生抑制因子，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤、细肌肉瘤、乳腺癌和喉癌。这一观察结果与在 ALKBH3 基因缺陷细胞中观察到的抑制效果相吻合。m1A-MeRIP-seq（存入 GEO 数据库：GSE213748，图 4I）和 m1A-MeRIP-qPCR （图 4J）都表明，眼部黑色素瘤细胞中的 m1A 修饰水平在 ALKBH3 抑制后得到恢复。通过 RNA-seq（存于 GEO 数据库：GSE213681，图 4K）和 qPCR（图 4L）验证了抑制 ALKBH3 后 SP100 在 mRNA 水平上显著上调。Western 印迹检测（图 4M）显示，SP100 在 ALKBH3 抑制细胞中的蛋白水平也有所增加。总之，这些数据表明，ALKBH3可能会通过去除其m1A修饰来抑制SP100的表达水平。

图4. ALKBH3 通过去除 SP100 的 m1A 修饰抑制其表达

5. SP100A 是眼部黑色素瘤的肿瘤抑制因子

         从眼部黑色素瘤细胞（92.1）和正常黑色素细胞（PIG1）获得的 RNA-seq 数据显示，SP100A 中的信号很突出，而 SP100A 未包含的外显子中的信号则可以忽略不计（图 5A）。此外，使用各种引物进行了 qPCR。这些引物包括一组专为 SP100A 设计的引物（称为 SP100-P1）和另一组检测 SP100B、SP100C 和 SP100HMG 的引物（称为 SP100-P2）。在眼部黑色素瘤细胞和正常色素细胞中观察到了 SP100A 的 RNA 表达（图 5B）。这些结果表明，SP100A 在实验环境中大量表达，而其他同工酶（SP100B、SP100C 和 SP100HMG）的表达则微乎其微。值得注意的是，通过RNA-seq（图5A）、qPCR（图5B）和Western印迹检测（图5C）发现，与正常色素细胞相比，眼黑色素瘤细胞中SP100A的RNA表达水平也明显下降。为了全面揭示 SP100A 在眼部黑色素瘤中的功能，测定了 SP100A 在眼部黑色素瘤临床样本中的表达。值得注意的是，SP100A在眼部黑色素瘤样本中的表达量明显下降（图5D和E）。更重要的是，在作者队列（图5F）和TCGA队列（图5G）中，SP100A的缺失与不利的预后有关。

         过表达 SP100A 后，所有受测的眼黑色素瘤细胞的增殖能力都减弱了（图 5H）。此外，与对照组相比，过表达 SP100A 的黑色素瘤细胞形成的菌落更小更少（图 5I 和 J）。此外，在眼部黑色素瘤细胞中引入 SP100A 后，还观察到癌症转移能力受到明显抑制（图 5K 和 L）。随后评估SP100A过表达细胞中PML的表达情况。结果，外源过表达 SP100A 导致 PML 蛋白水平显著升高（图 5M）。总之，这些功能增益数据揭示了SP100A负责PML核凝聚体的形成，是眼癌的肿瘤抑制因子。

图5. SP100A 在眼部黑色素瘤中发挥肿瘤抑制因子的作用

6.沉默SP100A会部分削弱ALKBH3缺陷细胞的肿瘤抑制效果

         转染 SP100A-shRNA 到三个眼黑色素瘤细胞，在细胞生长过程中，SP100A的缺失部分（50%～60%）挽救了ALKBH3抑制作用（图6A，红线），SP100A缺失的细胞对ALKBH3缺失的抵抗力更强（图6A）。同样，SP100A沉默的细胞比对照组出现更多的菌落（图6B，红色和橙色柱）。此外，抑制SP100A可显著增强细胞迁移能力，并影响ALKBH3缺陷黑色素瘤细胞的抑制效果（图6C）。最重要的是，SP100A的敲除进一步挽救了ALKBH3缺失黑色素瘤细胞的正位肿瘤形成（图6D和E）。同样，在野生型（图 6F，泳道 1 和 3）和 ALKBH3 缺失型眼黑色素瘤细胞（图 6F，泳道 2 和 4）中，稳定敲除 SP100A 会导致 PML 表达受损。这些结果表明，ALKBH3 通过减少 SP100A 介导的体内和体外 PML 体来促进眼黑色素瘤。。

图6. SP100A沉默可部分阻断ALKBH3敲除的抗癌作用

7. SP100A 的 m1A 修饰可增强其 RNA 稳定性和翻译功效

         检测SP100A mRNA 与 YTHDF1、YTHDF2 和 YTHDF3 的 RNA 结合情况。RNA免疫沉淀分析表明，YTHDF1能特异性地识别SP100A mRNA；然而，YTHDF2和YTHDF3仅表现出有限的相互作用强度（图7A）。此外，在TCGA队列中，YTHDF1与SP100A的表达呈显著正相关（R = 0.61，P< 0.0001）（图7B），这与YTHDF1是识别SP100A的必要条件这一假设完全吻合。此外，YTHDF1沉默可显著抑制SP100A的表达，并完全挽救ALKBH3沉默介导的SP100A水平升高（图7C和D）。综上所述，这些数据表明 YTHDF1 起着 SP100A 阅读蛋白的作用。

         然后，确定SP100A mRNA 的特定 m1A 修饰位点。在 SP100A 的 5′ UTR 中，根据确定的峰值找到了五个潜在的 m1A 位点（图 4I，）[c.44A（TGTGG）、c.54A（AGACG）和 c.67A （TGAGG），以及 c.92A/c.93A （GGAAG）]，并将每个 A 突变为一个 A。 A (TGAGG)，以及 c. 92A/c. 93A (GGAAG)]，并将每个 A 突变为 T。然后我们将相应的野生型和突变的 5′ UTR 克隆到 pmirGLO 载体中（图 7E，上面板）。荧光素酶报告基因检测表明，c.A92T 的信号减弱，而其他突变组的信号保持不变（图 7E）。此外，ALKBH3 缺失的细胞中 SP100A 的 RNA 稳定性增强，这与 ALKBH3 缺失后 SP100A RNA 表达增加的结果一致（图 7F）。重要的是，92.1 细胞中的多聚体分析表明，稳定敲除 ALKBH3 会导致多聚体部分的 SP100A mRNA 丰度明显提高（图 7G），而多聚体部分通常具有有效的翻译能力。总之，这些结果表明，SP100A mRNA 的 m1A RNA 甲基化有助于提高转录后的 RNA 稳定性和翻译能力。

图7. SP100A 的 m1A 修饰增加了其 RNA 的稳定性和翻译效率

结论

         综上所述，本研究初步证明了m1A的修饰对于肿瘤抑制基因的表达是必要的，扩展了目前对m1A在肿瘤进展过程中动态功能的理解。此外，这些结果表明，乳酸驱动的ALKBH3对PML核凝聚物的形成是必不可少的，这弥补了我们对m1A修饰，代谢重编程和相分离事件的知识。

实验方法：

         细胞培养，点印记，免疫荧光，WB，RNA提取和qRT-PCR，质粒构建，慢病毒的包装和稳定细胞系的产生，细胞增殖，克隆形成，Transwell，异种移植物模型，ChIP-seq，CUT&Tag，MeRIP-seq，RNA-seq，iTRAQ蛋白组学分析，RIP-qPCR，荧光素酶报告实验，多肽体谱

参考文献

         Gu X, Zhuang A, Yu J, Yang L, Ge S, Ruan J, Jia R, Fan X, Chai P. Histone lactylation-boosted ALKBH3 potentiates tumor progression and diminished promyelocytic leukemia protein nuclear condensates by m1A demethylation of SP100A. Nucleic Acids Res. 2023 Dec 20: gkad1193. doi: 10.1093/nar/gkad1193. Epub ahead of print. PMID: 38118002.