单核RNA测序揭示宫颈鳞状细胞癌和腺癌之间的异质性

         宫颈鳞状细胞癌（CSCC）和腺癌（CAde）是宫颈癌（CC）的两种主要病理类型，但其肿瘤和免疫微环境的高分辨率异质性仍然难以捉摸。在这里，作者对5个CSCC和3个CAde样本进行单核RNA测序（snRNA-seq），并系统地概述了它们的特异性转录组图谱。作者发现，与CAde中的细胞相比，CSCC中的CD8+T细胞更具细胞毒性，但T耗竭更低，并且吞噬作用的MRC1+巨噬细胞在CSCC中特异性富集。有趣的是，作者发现促肿瘤相关的肌成纤维（myoCAF）和癌症相关的血管成纤维（vCAF）在CSCC中更丰富，并进一步验证了它们在体外的促肿瘤作用。此外，作者还通过揭示恶性上皮细胞转录谱的异质性，鉴定了一些针对CSCC的特异性化疗药物（达沙替尼和达马莫德）和CAde（乙嘧啶和拉帕替尼），并进一步验证了它们在细胞系和构建的CC衍生类器官中的特异敏感性。细胞-细胞通信网络显示，NRG1-ERBB2和FN1-ITAG3的通路分别对CAde和CSCC具有特异性，这可能部分解释了已鉴定化疗药物的特异性。作者的研究描述了CSCC和CAde之间的免疫异质性和特定的细胞相互作用，这为揭示发病机制和设计个性化治疗提供见解。该研究于2023年10月发表在《eBioMedicine》，IF 11.1分。

技术路线：

主要研究结果：

1. CSCC和CAde的单细胞转录组景观

         为阐明CSCC和CADE之间肿瘤间和肿瘤内的异质性，作者对五个CSCC样本（p8、p21、p48、p53、p54）和三个CADE样本进行snRNA序列（图1A）。经过数据质量控制和过滤，总共收集了82719个单细胞，平均每个细胞捕获1854个基因。所有这些单细胞被注释为九个主要细胞群：上皮细胞（CDKN2A、CDH1、EPCAM、MUC5B、WFC2和PTPRT）、间充质细胞（COL1A1、LAMA2和ACTA2）、T细胞（CD247、CD2、CD3E）、髓系细胞（MSR1和HLA-DPB1）、血管内皮细胞（EGFL7和EMCN）、血浆细胞（IGKC和MZB1）、淋巴内皮细胞（CCL21和Prox1）、B细胞（MS4A1）和母细胞（KIT和CPA3）（图1B）。上皮细胞是CSCC和CADE样本中最丰富的细胞类型。不同个体中九种细胞类型的分数变化很大，表明CC中个体间异质性巨大（图1d和e）。

         为进一步探索CSCC和CAde之间上皮细胞的异质性，作者首先将上皮细胞分为21个不同的簇。作者测量了每个上皮细胞簇与参考细胞（血管内皮细胞）相比的相对CNV评分，簇1/5/6/7/8/9/12/14/17/19与参考细胞相比具有更高的CNV评分，因此他们被归类为恶性上皮细胞（图1f和g）。作者还测量了每种细胞类型的细胞周期状态，并观察到癌症细胞显示出最低的G1期百分比，这表明大多数癌症细胞在DNA复制中更活跃（图1h）。

图1：宫颈鳞状细胞癌和腺癌单细胞表达图谱的构建

2. CSCC和CAde中T细胞和巨噬细胞亚群比例和功能不同

         T细胞是肿瘤微环境的主要组成部分，在抗肿瘤中起着关键作用，作者旨在进一步剖析CSCC和CAde之间T细胞亚群和功能状态的异质性。根据其标记基因将T细胞进一步分为七个簇，即T_CD8+（CD8A和CD8B）、T_naive（TCF7、IL7R和CCR7），T_reg（IKZF2、IL2RA和FOXP3）、T_ex（PDCD1和LAG3）、T_nk（GNLY和NCAM1）、T_eff（NKG7、CX3CR1和FCGR3A）、T_prolif（CENPF、MKI67和TPO2A）（图2a-c）。总的来说，T_CD8+和T_naive在CSCC和CAde中丰富。虽然P值没有统计学意义，但CSCC中T_reg的比例似乎更高，CAde中T_ex的比例更高（图2d）。作者还测量了每个簇的细胞毒性/耗竭/treg评分，以评估T细胞的功能状态，其中T_eff、T_ex和T_reg分别获得最高的细胞毒性、耗竭和treg评分（图2e）。然后进一步比较了这两种病理类型在细胞毒性和衰竭功能方面的差异。如图2f所示，与CAde相比，CSCC获得更高的细胞毒性评分，但消耗评分较低。TCGA队列中的CSCC患者也被证实与CAde患者相比具有更高的细胞毒性评分（图2g），并且在TCGA数据库中的所有CC队列（Log-rank P=0.00283，Log-rank检验）、CSCC队列（Log-lank P=0.0026，Log-rak检验）中具有更高细胞毒性评分的患者有更好的预后（图2h）。

         髓细胞在肿瘤微环境中也发挥着重要作用。在该研究中，共有6267个髓系细胞根据其标记基因重新聚类为14个亚簇，包括7个巨噬细胞（Macro-C1:PPARG；Macro-C2:SELENOP和MRC1；Macro-C3:SH3BP5；Macro-C5:GBP5；Macro-C6:VCAN和FCN1；Macro-C7:SP1）、5个树突细胞（DC-C1:CD1A；DC-C2:LAMP3和CCR7；DC-C3:CLEC9A；DC-C4:BACH2；DC-C5:LILRA4）、1个循环细胞（TOP2A和MKI67），和未知亚型（图2i）。每个样品中七个巨噬细胞亚簇的组分变化很大（图2j）。功能富集分析显示，Macro-C1参与脂质分解代谢过程和固醇或胆固醇转运，在调节巨噬细胞的吞噬作用和炎症因子方面发挥关键作用。Macro-C4主要与蛋白质定位和细胞-细胞粘附有关。其他集群具有一些共同的功能特征，例如白细胞和T细胞激活。然而，抗原处理和呈递的相关途径在Macro-C2中显著富集，这是吞噬作用随后的反应，其在免疫调节中发挥关键作用（图2k）。为进一步剖析已鉴定巨噬细胞簇的异质性，根据已知的基因marker测试了他们的功能评分。如图2l所示，所有这些巨噬细胞簇都不能根据M1、M2、吞噬作用、血管生成以及骨髓来源的抑制细胞（MDSC）的评分很好地分离。值得注意的是，Macro-C2的吞噬作用得分最高，这与其抗原处理和呈递的特定功能一致。此外，与CAde相比，CSCC获得更高的吞噬作用得分（图2m）。作者进一步在收集的样本中验证，与CAde相比，Macro-C2（MRC1+/CD68+）在CSCC中的含量明显更高。

         总之，这两种病理亚型的T细胞和巨噬细胞亚群的不同组分和功能状态反映了它们对CC的特异性免疫反应，这可能为免疫治疗提供见解。

图2：CSCC和CAde中T细胞和巨噬细胞的特征和功能状态

3. 与CAde相比，促肿瘤的vCAFs在CSCC中占主导地位

         作者进一步对间充质细胞进行重新聚类，并鉴定了四种主要的细胞类型，包括12种成纤维细胞亚型（COL1A1和COL1A2）、两种平滑肌细胞亚类型（ACTA2、ACTG2和MYH11）、三种周细胞亚型（NOTCH3和RGS5）和另一种未定义的成纤维细胞（PTPRC和MUC16）（图3a-c）。为了根据通路激活和基因表达谱进一步研究成纤维细胞的不同功能表型，使用分级聚类将12簇成纤维细胞分为四种主要表型（图3d）。在这些亚型中，由Fib-C1/C10/C11/C12簇组成的ITGA1+成纤维细胞被定义为具有高表达ITGA1、POSTN、MMP11、FN1、FAP、COL1A1和COL8A1。 ADAMTS19+成纤维细胞由具有高表达ADAMTS19、NCAM1和COL14A1的Fib-C2/C3组成。LMCD1+成纤维细胞由高表达LMCD1、EPAS1、VEGFA、COL4A1和SOD2的Fib-C4/C5组成。PAMR1+成纤维细胞由具有高表达PTCH1和DACH1的Fib-C6/C7/C8/C9组成（图3e）。根据已报道的成纤维细胞分类，GO注释显示，PAMR1+成纤维细胞参与器官发育和细胞对激素刺激的反应，即发育CAFs（dCAFs）。LMCD1+成纤维细胞涉及VEGFA-VEGFR2信号通路、伤口愈合、管形态发生、MAPK和PI3K-Akt-mTOR信号通路，进一步定义为vCAFs。ADAMTS19+成纤维细胞主要参与NABA CORE MATERISOME和ECM组织，被定义为基质CAFs（mCAFs）。 myoCAF主要介导细胞外基质（ECM）组织的途径，MET促进细胞运动（图3f）。

         接下来，使用monocle2来推断成纤维细胞的潜在发育轨迹。有趣的是，作者发现mCAFs和dCAF主要位于发育轨迹的起点，而myoCAF和vCAFs分别位于两个分支（图3h）。在CSCC和CAde中观察到成纤维细胞的相同发育轨迹（图3i）。此外，在发育过程中，基因表达谱进一步聚类为三个不同的聚类，进一步的功能富集分析表明，癌症相关通路（包括MAPK信号通路和胰岛素受体信号通路）在vCAFs转变过程中是活跃的。而ECM组织、结缔组织发育和胶原代谢过程在myoCAF过渡过程中是活跃的（图3j）。为进一步探索伪时间的调节机制，鉴定了异常活跃的TF。一些转移相关的转录因子（如BACH2、TWIST2、CREB5和CUX1）和促血管生成转录因子（FOXO1、BACH1）参与vCAFs的发育过程，而ETV6和STAT2参与myoCAFs的发育进程（图3k）。

图3：CSCC和CAde中间充质细胞的特性和亚簇

         然后，作者使用TCGA队列测量已确定的成纤维细胞亚型的预后意义。在TCGA数据库中的所有CC队列、CSCC队列中，myoCAF与患者总生存率呈负相关（图4a）。在TCGA数据库中的所有CC队列中，vCAFs也与患者总生存率呈负相关（图4a）。作者进一步验证了与使用mIF外部样本的CAde相比，vCAFs和myoCAFs在CSCC中更丰富（图4b和c）。然后，作者从一个收集的CC样品（患者#46）中提取并培养原代成纤维细胞。通过流式细胞术对原代myoCAFs（POSTN+/COL1A1+）和vCAFs（SOD2+/COL1A1+1）进行分类，并通过免疫荧光染色进一步验证它们（图4d）。Transwell分析显示，myoCAFs和vCAFs的条件培养基（CM）都可以显著促进CC细胞的迁移能力（图4e和f）。与myoCAFs或对照组的CM相比，vCAFs的CM似乎显示出更高的促进血管生成能力（图4g）。

         此外，vCAFs中TGFB1和VEGFA的表达水平显著高于myoCAFs，这被证明可以促进肿瘤进展和血管生成（图4h）。总之，该研究结果证实，CC样品中的原代vCAFs和myoCAF在体外显示出促转移的潜力。

图4：已鉴定的肿瘤前成纤维细胞的功能验证

4. CSCC和CAde的不同恶性上皮亚型及其差异表达基因

         为更好地揭示CSCC和CAde的特定肿瘤内在特征，作者将所有恶性上皮细胞重新划分为11个簇，并鉴定了它们的标记基因（图5a-c）。有趣的是，基于GSVA分析，来源于CSCC和CAde的恶性上皮亚群可以很好地分离（图5d）。值得注意的是，AKT、MTOR和ERBB2的相关通路在CAde样本中是活跃的，而HINATA_NFKB_IMMU-INF在CSCC样本中是活跃的。这些发现表明CSCC和CAde之间具有不同的内在功能，这有助于揭示CSCC和CAde患者的不同发病机制和选择敏感的靶向药物。

         癌症干性已被证明通过排出T细胞来影响一系列人类癌症的免疫抑制。作者测量了每个簇的干性评分，发现与CSCC相比，CAde获得更高的肿瘤干性，这表明CAde具有更具抑制性的免疫微环境（图5e）。基于此，作者旨在构建一个能够区分CSCC和CAde的基因面板。在重置阈值（|Log2FC|>1，P<0.05，Wilcoxon秩和检验）后，建立了包含14个预后相关基因的基因集（图5f）。为了评估建立的判别基因组的准确性，作者在组织微阵列上进行了IHC染色。如图5g和h所示，证实MTSS1在CSCC样品中过表达，而POLA1在CAde样品中上调。ROC曲线证实，该基因组在CAde和CSCC分类方面表现出良好的性能（图5i）。

5. 靶向CSCC和CAde的化疗药物的鉴定

         结合已鉴定的DEG，使用SCENIC算法进一步剖析上游调控分子（即TF）的异质性。如图5j所示，针对CSCC鉴定了一系列特异性TF（HOXD8、ETS1、RXRA、MAFB、TBX6、IKZF1、STAT2、STAT1、MAF、SMAD3、GRHL3、TP63和HOXD10）和CAde（TEAD1、HNF4A、RFX2、XBP1、CREB3L1和HNF4G）。作者进一步测量了它们在CSCC（SiHa、CaSki和ME-180）和CAde（HeLa）细胞系以及TCGA队列中的表达（图5k）。TF基因调控网络表明，CAde的过表达基因主要受CAde特异性TF的调控，在CSCC中反之亦然（图5l）。然后，使用Beyondcell算法基于恶性细胞的表达谱来预测药物敏感性（图5m）。作者随机选择了一些药物，以进一步验证药物筛选的预测准确性。如图5n所示， CAde特异性药物（二氢叶酸还原酶抑制剂：嘧啶胺；ERBB2抑制剂：拉帕替尼）在HeLa中的IC50值比在CaSki中的小。相反，CSCC特异性药物（STAT5抑制剂：达沙替尼；MAPK抑制剂：多马匹莫德）在CaSki中具有更好的细胞毒性功能。作者还从临床CSCC和CAde样本中构建了类器官，以更好地测试药物敏感性，结果与CC细胞系中的结果基本一致（图5o和p）。这些发现表明作者鉴定的药物具有很强的可靠性，值得未来进一步探索。

         总之，作者区分了CC的两种亚型之间的特定恶性上皮亚群，并基于它们的DEG建立了一个判别基因组。此外，作者预测并证实了对CSCC和Cade敏感的特异性药物，这可以为临床实践中探索两种病理性CC的个体化治疗提供见解。

图5：CSCC和CAde中恶性细胞的转录组异质性

6. 癌细胞与成纤维细胞在CSCC和CAde中的特异性细胞相互作用

         为研究CSCC和CAde之间细胞-细胞相互作用的异质性，使用CellphoneDB数据库中的一组配体-受体（L-R）对来预测九种已鉴定的主要细胞类型之间的潜在相互作用。与CSCC相比，CAde具有更丰富的相互作用对，尤其是在上皮细胞和间充质细胞中（图6a-c）。然后鉴定了属于CSCC和CAde的特异性配体-受体对。有趣的是，作者发现CAde中的特异性配体-受体对比CSCC中的多（图6d）。约68.5%的显著相互作用对由CAde和CSCC共享，而23.5%的相互作用对是CAde特异性的。此外，在CSCC和CAde中，上皮细胞主导了来自间充质细胞的特异性信号传导，这是作者以下分析的主要重点（图6e）。进一步的CellChat分析显示，癌症细胞和已鉴定的CAF（NRG1-ERBB2/4和FN1-CD44/ITGAV/ITGA3/ITGB6/ITGB8/ITGB1）之间的信号通路分别在CAde和CSCC中特异性富集（图6f）。值得注意的是，一些受体（ERBB2、ITGA3和ITGB6）主要在癌症细胞中表达，其假定的配体（NRG1和FN1）在CAF中过表达（图6g）。此外，NRG1-ERBB2和FN1-ITGA3的相互依赖的配体-受体对分别在CAde和CSCC的细胞成分中表现出显著表达（图6h和i）。

         有趣的是，已鉴定的拉帕替尼是一种ERBB2抑制剂，对CAde样品特别敏感。先前的研究已经证明，STAT5和MAPK是恶性肿瘤中整合素的关键下游分子，作者发现靶向STAT5和MAPK分子的达沙替尼和Doramapimod对癌症细胞系和CSCC的类器官显示出特异性敏感性。总的来说，作者确定了CAFs和癌症细胞之间CSCC（FN1-ITGA3）和CAde（NRG1-ERBB2）的特异性细胞相互作用，这也可以为这两种不同CC类型选择有前景的治疗性化疗药物提供见解。

图6：CSCC和CAde中恶性细胞与成纤维细胞之间的特异性通讯模式

结论：

         在这里，我们描述了单细胞溶液中五个CSCC和三个CAde样本的不同转录组图谱。这两种病理类型之间关于上皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞的异质性已经得到了很好的证明，一些有趣的发现（例如，特异性化疗药物、鉴定的LECs、鉴定的myoAF或vCAFs）通过mIF染色、提取原代CAFs、构建CC类器官等得到了进一步验证（图7）。与之前通过单细胞RNA测序对CC进行的研究相比，我们的研究为揭示CSCC和CAde之间致癌作用和肿瘤微环境的巨大异质性，以及为未来设计个性化治疗策略提供了宝贵的资源。

参考文献：

         Lin S, Sun Y, Cao C, Zhu Z, Xu Y, Liu B, Hu B, Peng T, Zhi W, Xu M, Ding W, Ren F, Ma D, Li G, Wu P. Single-nucleus RNA sequencing reveals heterogenous microenvironments and specific drug response between cervical squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. EBioMedicine. 2023 Nov;97:104846. doi: 10.1016/j.ebiom.2023.104846. Epub 2023 Oct 24. PMID: 37879219; PMCID: PMC10618708.