L-精氨酸代谢可抑制关节炎和炎性骨丢失

类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，其特征是关节疼痛、肿胀以及软骨和骨破坏。RA影响全球1%的人口，并构成残疾的一个关键因素。炎症是RA骨丢失的关键诱因，导致骨侵蚀增强、过早骨质疏松和骨折风险增加。因此，慢性炎症会扰乱骨稳态，导致骨吸收超过骨形成。TNFα是一种关键的促炎细胞因子，也是众所周知的引发破骨细胞过度分化的因素。在破骨细胞中，TNFα刺激的下游信号通路如NF-κB和MAPK-AP1被激活。破骨细胞的分化需要大量的能量。氧化磷酸化有助于破骨细胞的分化，而糖酵解影响破骨细胞的吸收活性。此外，线粒体途径也参与了破骨细胞的功能，因为线粒体生物发生和呼吸的主要调节因子PGC-1α的缺乏会降低破骨细胞的吸收活性。炎症可能通过改变破骨细胞的代谢而改变其功能状态。然而，到目前为止，还没有研究探讨炎症条件下破骨细胞的代谢特性。该研究发表在《Annals of the Rheumatic Diseases》，IF：27.4。

技术路线：

主要研究结果：

1. L-精氨酸可抑制关节炎和炎性骨丢失

为了研究L-精氨酸是否可以预防炎症和全身性炎性骨丢失，作者使用了血清诱导性关节炎（SIA）模型，并在血清注射后第0日或第4日口服补充了L-精氨酸（图1A）。L-精氨酸显著减少了临床关节炎（图1B）。作者还分析了SIA小鼠的胫骨，发现在L-精氨酸和溶剂治疗之间，骨量没有显著差异（图1C、D）。尽管如此，L-精氨酸减少了胫骨破骨细胞的数量和大小（图1E、F）。

作者假设长期的l -精氨酸治疗可能有更好的结局。因此，作者从首次免疫后第23日开始，用L-精氨酸对患胶原诱导关节炎（CIA）的DBA/1J小鼠进行治疗（图1G）。与SIA模型相似，L-精氨酸显著改善了关节炎症，如关节炎评分降低所示（图1H）。胫骨和椎骨的μCT分析表明，L-精氨酸治疗改善了骨丢失，显著增加了骨体积和骨小梁数量（图1I，J）。使用TRAP染色对破骨细胞进行的组织形态计量分析显示，L-精氨酸治疗的CIA小鼠的破骨细胞数量显著受到抑制（图1K，L）。有趣的是，骨髓上清液中的TNFα表达和RANKL/OPG比率没有改变，这表明尽管分别存在促炎和促破骨细胞因子如TNFα和RANKL，L-精氨酸可能改善骨丢失。

最后，L-精氨酸对关节炎的有益作用也在hTNFtg小鼠中得到证实，hTNFtg小鼠是自发性炎症性关节炎的模型。出生后6周，在饮用水中补充L-精氨酸（图1M）。与其他两个实验模型一样，在L-精氨酸治疗的小鼠中，关节肿胀减轻，同时握力改善（图1N，O）。L-精氨酸通过减少破骨细胞数量抑制关节炎和炎性骨丢失。

图1 L-精氨酸保护三种小鼠关节炎模型的骨丢失

2. L-精氨酸可抑制TNFα诱导的破骨细胞生成

接下来，作者用WT骨髓细胞进行破骨细胞分化实验，这些细胞被TNFα刺激以模拟促炎微环境。在整个分化过程中或仅在后期阶段补充L-精氨酸（图2A）。所使用的L-精氨酸浓度无任何毒性作用（图2B）。正如预期的那样，TNFα刺激（40ng/mL）增强了破骨细胞数量，而10mM L-精氨酸显著减少了破骨细胞分化（图2C，D）。有趣的是，与在整个分化过程中补充L-精氨酸相比，在分化后期补充L-精氨酸能更有效地抑制破骨细胞的生成（图2C，D）。TNFα刺激促进破骨细胞中F-肌动蛋白环的形成，而L-精氨酸破坏了F-肌动蛋白环的形成（图2E）。在TNFα刺激的细胞中，L-精氨酸也降低了骨吸收活性（图2F，G）。破骨细胞相关基因的动态分析显示了它们在分化过程中的变化。它们的表达在TNFα刺激后增加，但在L-精氨酸治疗后显著减少（图2H）。总之，L-精氨酸在体外抑制破骨细胞分化，尤其是在炎症条件下。

图2 L-精氨酸降低TNFα诱导的破骨细胞生成和再吸收活性

3. L-精氨酸促进氧化磷酸化和ATP生成

为了确定L-精氨酸的功能，作者对TNFα刺激或未刺激的L-精氨酸处理的破骨细胞进行了RNA测序。在未受刺激的细胞中，L-精氨酸处理的细胞中只有少数基因和相关通路被富集（图2I）。而当细胞被TNFα刺激时，KEGG通路分析显示L-精氨酸后氧化磷酸化通路基因强富集（图2J）。GSEA进一步证明，与TNFα刺激的细胞相比，TNFα/L-精氨酸处理的细胞中氧化磷酸化显著富集（图2K）。热图分析还突出了与氧化磷酸化相关的基因，这些基因在TNFα/L-精氨酸处理的细胞中显著上调（图2L）。

为了进一步证实TNFα/L-精氨酸对细胞氧化磷酸化的促进作用，作者进行了细胞外通量测定。TNFα刺激促进WT细胞的糖酵解，而L-精氨酸不影响糖酵解（图3A）。与此同时，TNFα抑制氧化磷酸化并促进ATP生成，这一过程被L-精氨酸（10mM）逆转（图3B，C）。在TNFα刺激后，糖酵解ATP生成增加，但被L-精氨酸转化为氧化磷酸化（图3D，E）。

为了研究单细胞水平的能量代谢，作者对四个处理组分离的前破骨细胞进行了SCENITH实验。在TNFα刺激的细胞中，精氨酸增加了线粒体依赖性，降低了糖酵解能力（图3F、G）。此外，L-精氨酸引起的氧化磷酸化增加与葡萄糖消耗增加无关（图3H）。因此，作者探索了线粒体膜电位的可能变化。JC-1染色显示TNFα刺激后线粒体膜电位受损，而L-精氨酸恢复了膜电位（图3I，J）。最后，当用鱼藤酮和抗霉素阻断氧化磷酸化时，L-精氨酸的作用仅在TNFα刺激的条件下以剂量依赖性的方式被消除（图3K-N）。

图3 L-精氨酸促进炎症条件下破骨细胞氧化磷酸化和ATP的产生

4. 精氨酸酶-1诱导介导L-精氨酸抑制破骨细胞

为了研究作者模型中的转录调控，作者根据作者的RNA测序数据进行了转录因子富集分析。有趣的是，作者发现c-Jun在来自DEGs的所有三个转录因子数据库中都富集（图4A）。由于c-Jun是已知的控制破骨细胞分化的转录因子，并且c-Jun的表达与巨噬细胞中精氨酸酶-1（Arg-1）的表达呈负相关，因此在作者的四种培养条件下，作者对c-Jun的蛋白水平进行了研究。TNFα增强了C-Jun的表达，但L-精氨酸显著降低了C-Jun的表达，尤其是在破骨细胞分化后期补充L-精氨酸时（图4B）。接下来，作者分析了在TNFα刺激下c-Jun在破骨细胞生成中的作用。为此，作者分离了cJun ΔLysM小鼠和同窝对照组小鼠的骨髓细胞。即使在TNFα刺激后，c-Jun缺陷细胞中的破骨细胞数量也较低（图4C，D）。有趣的是，在TNFα刺激后，c-Jun缺陷的破骨细胞中，Arg1的表达显著升高，而Arg2无变化（图4E）。因此，作者研究了精氨酸-1在L-精氨酸介导的破骨细胞抑制中的作用。在L-精氨酸处理的CIA小鼠的足爪组织裂解液中，精氨酸酶活性升高，而尿素水平不变，亚硝酸盐水平降低（图4F）。这些数据表明，c-Jun控制Arg1的表达，从而介导L-精氨酸对破骨细胞分化的抑制作用。

为了验证c-Jun是否在转录水平调控Arg1的表达，特别是在TNFα刺激下，作者纳入了Arg1转录起始位点上游的5000 bp，并通过计算机模拟JASPAR数据库，预测了Arg1启动子上的8个假定的c-Jun结合位点（图4G）。然后用抗c-jun抗体对TNFα刺激的破骨前细胞进行ChIP-qPCR。事实上，c-Jun可以在稳定状态下与启动子位点3、4、5和8结合，在TNFα刺激下与启动子位点1、2、4、6和8结合（图4G）。有趣的是，染色质重塑标志物表明c-Jun结合位点的抑制模式，TNFα刺激后，Arg1启动子的H3me3K27甲基化增强，而H3me3K4甲基化未检测到变化（图4H）。这些结果表明，TNFα通过c-Jun下调Arg1的表达。

接下来，作者分析了来自两个Arg-1条件性敲除小鼠的骨髓来源的破骨细胞。正如预期的那样，L-精氨酸可以减少WT细胞的破骨细胞分化，但在TNFα刺激后Arg-1缺陷细胞中没有这种作用（图4I-L）。

综上所述，这些结果表明Arg-1在TNFα刺激后允许L-精氨酸抑制破骨细胞生成中起重要作用。

图4 精氨酸酶-1的诱导介导L-精氨酸抑制破骨细胞

5. L-精氨酸在炎症刺激下重新编程嘌呤代谢

为了研究L-精氨酸补充后的代谢通量，作者首先使用13 c同位素标记进行了L-精氨酸的代谢示踪。如图5A所示，在13 C 6 - L-精氨酸补充后，标记为13 C同位素的下游代谢物为鸟氨酸、精胺、n -乙酰-精脒、n -乙酰-瓜氨酸/瓜氨酸、d -脯氨酸、吡咯啉和吡咯烷。有趣的是，从各代谢物的同位素分布图中可以看出，TNFα刺激增加了13 C 6 -L-精氨酸的消耗，而13 C 6 >- L-精氨酸的补充增加了其细胞浓度。此外，添加C 6 - L-精氨酸促进了13 C 4 -鸟氨酸、13 C 5 - d -脯氨酸、13 C 4 -精胺、13 C 4 - n -乙酰-精胺、13 C 4 -吡咯啉和13 C 4 -吡咯烷的产生。然而，在TNFα刺激下，13 C 6 - L-精氨酸减少了13 C 5 -鸟氨酸的产生，这表明鸟氨酸只在炎症条件下消耗。综上所述，这些数据表明，L-精氨酸生物利用度的提高确实使代谢通量向精氨酸-1方向倾斜。

接下来，为了进一步阐明L-精氨酸处理后的细胞内代谢变化以及阐明下游代谢通路，作者对L-精氨酸和TNFα刺激或不刺激的破骨细胞进行了非靶向代谢组学分析。正如预期的那样，代谢组学数据的通路富集证实，在l -精氨酸处理的破骨细胞中，精氨酸和脯氨酸代谢增加（图5B）。最有趣的是，与TNFα刺激的细胞相比，TNFα L-精氨酸处理的细胞中嘌呤代谢富集（图5B）。次黄嘌呤和肌苷的生成增加，可能是由于ATP生成增加（图5C，D）。在TNFα L-精氨酸处理的细胞中，腺苷和腺嘌呤的产生显著减少。与代谢组学结果一致，RNA-seq数据还表明，在TNFα L-精氨酸处理的细胞中，嘌呤代谢相关通路在Gene Ontology数据库中显著富集（图5E）。编码与嘌呤代谢相关的酶的基因也发生了相应的变化（图5F）。特别是腺苷脱氨酶（ADA）和Nt5c1a在TNFα刺激的细胞中被L-精氨酸单独上调（图5F）。综上所述，这些结果揭示了L-精氨酸在炎症刺激下重编程嘌呤代谢。

图5 L-精氨酸干扰TNFα刺激细胞的嘌呤代谢

为了进一步分析嘌呤代谢在破骨细胞生成过程中的作用，作者诱导破骨细胞分化，并用肌苷或次黄嘌呤处理细胞。肌苷和次黄嘌呤均可抑制体外破骨细胞生成，尤其是在TNFα刺激后（图6A，B）。通过使用ADA抑制剂（戊司他丁或红-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤）阻止肌苷和次黄嘌呤的产生，作者可以逆转炎症环境下L-精氨酸对破骨细胞分化的抑制作用（图6C-E）。

接下来，作者在补充L-精氨酸的CIA小鼠体内分析了ADA抑制的效果（图6F）。与之前一样，L-精氨酸显著改善了关节炎，而喷司他丁注射液完全恢复了关节炎（图6G）。胫骨的组织形态计量学分析表明，补充L-精氨酸减少了破骨细胞，并保护了炎性骨丢失。然而，ADA抑制可逆转L-精氨酸的作用（图6H，I）。综上所述，在体外和体内实验中，L-精氨酸诱导的嘌呤代谢介导了对炎症性破骨细胞生成的抑制。

图6 L-精氨酸通过控制腺苷脱氨酶来减轻炎性骨丢失

6. RA患者精氨酸水平的改变和L-精氨酸对人破骨细胞生成的抑制作用

为了研究RA患者的精氨酸水平是否有变化，作者对23例RA患者和29名年龄和性别匹配的健康对照者的血清样本进行了超高效液相色谱-质谱分析，以确定参与尿素循环的氨基酸水平。与健康对照者相比，RA患者血清中精氨酸水平显著升高，而鸟氨酸水平降低，瓜氨酸和脯氨酸水平无变化（图7A）。此外，在轻中度疾病活动（DAS28评分<5.2个单位）的RA患者中，精氨酸水平与疾病严重程度显著相关（图7B）。作者还在另一个类风湿关节炎前期患者队列中检测了这些氨基酸水平。有趣的是，在RA前期患者中，与健康对照相比，D-精氨酸水平升高，而鸟氨酸和D-脯氨酸水平显著降低，瓜氨酸水平无变化（图7C）。总之，精氨酸在RA和RA前期患者中表达显著升高，提示在疾病的早期阶段就存在精氨酸代谢失调。

最后，作者还在人类细胞中研究了L-精氨酸对破骨细胞的作用。用10mM L-精氨酸处理外周血单个核细胞来源的破骨细胞，并用20pg/mL TNFα刺激（图7D）。在MCSF和RANKL刺激的细胞和TNFα刺激的细胞中，L-精氨酸处理后均观察到破骨细胞数量和破骨细胞标志物表达显著减少（图7E-G）。因此，L-精氨酸也抑制人类破骨细胞的生成。

图7 类风湿关节炎患者精氨酸代谢的改变和L-精氨酸抑制人破骨细胞生成

结论：

综上所述，该研究表明L-精氨酸通过重编程破骨细胞的氨基酸代谢来抑制关节炎，炎症性破骨细胞生成和炎症诱导的骨丢失。因此，治疗性补充L-精氨酸可能是一种抑制关节炎炎症和保护炎性骨丢失的饮食策略。

实验方法：

小鼠实验，RNA测序和生物信息学分析，细胞外通量测定，单细胞能量代谢，质谱分析

参考文献：

Cao S, Li Y, Song R, Meng X, Fuchs M, Liang C, et al. L-arginine metabolism inhibits arthritis and inflammatory bone loss. Ann Rheum Dis. 2024 Jan 2;83(1):72-87. doi: 10.1136/ard-2022-223626.