眼黑色素瘤中组蛋白乳酸化和RNA的m1A甲基化修饰之间的调控机制

虽然N1-甲基腺苷（m1A）RNA修饰是RNA代谢的一个重要调节因子，但m1A修饰在肿瘤发生中的作用仍是一个谜。本研究发现组蛋白乳酸化通过去除SP100A的m1A甲基化，增强了ALKBH3的表达，同时减弱了肿瘤抑制性早幼粒细胞白血病蛋白（PML）凝集物的形成，促进了癌症的恶性转化。首先，ALKBH3在高危眼黑色素瘤中由于组蛋白的过度乳酸化水平而特异性上调，即m1A低甲基化状态。此外，多组学分析发现PML体的核心成分SP100A是ALKBH3的下游候选靶点。在治疗上，沉默ALKBH3在黑色素瘤的体外和体内均表现出高效的疗效，而这种疗效可通过消耗SP100A而逆转。从机理上讲，YTHDF1负责识别m1A甲基化的SP100A转录本，从而提高其RNA稳定性和翻译效力。最后，本文初步证明了m1A修饰是肿瘤抑制基因表达所必需的，从而拓展了目前对肿瘤进展过程中m1A动态功能的理解。此外，研究结果表明，乳酸化驱动的ALKBH3对PML核凝聚体的形成至关重要，揭示了m1A修饰、代谢重编程和相分离事件之间的相互关系，从而为靶向m1A重编程高效治疗肿瘤提供了一种新的治疗方法。本文于2023年12月发表在《Nucleic Acids Research》，IF：14.9。

技术路线

主要实验结果：

1.ALKBH3在眼部黑色素瘤中特异性增高且与不良预后相关

为了确定m1A修饰在眼部黑色素瘤发病机制中的作用，首先比较了眼部黑色素瘤样本（3个CoM样本和3个UM样本）和4个对照痣样本的总体m1A修饰水平。值得注意的是，眼黑色素瘤样本的m1A水平明显降低，这一点已通过Diot blot检测得到证实（图1A-B）。此外，去甲基化酶ALKBH3在肿瘤中的蛋白表达也增加了（图1C-E），这与眼黑色素瘤中m1A水平降低的发现一致。此外，ALKBH3的升高与不良预后有关（图1F），这进一步强调了ALKBH3在眼部黑色素瘤癌变过程中的重要性。

一致的是，与正常色素细胞（PIG1）相比，大多数黑色素瘤细胞系（MUM2B、OCM1、OMM2.3、OMM1、MEL290、92.1、CRMM1、CRMM2、CM2005.1）的m1A水平显著下降（图1G和H），ALKBH3水平显著升高（图1I-K）。此外，高通量转录组测序进一步证实了ALKBH3在眼黑色素瘤细胞系中的上调（图1L）。并且在这些细胞中，ALKBH3与m1A水平呈显著负相关，表明ALKBH3上调是m1A水平降低的原因（图1M）。

图一：眼部黑色素瘤的ALKBH3表达增加和m1A水平降低与存活率低有关

2.ALKBH3在体外和体内加速眼黑色素瘤的形成

为了探索ALKBH3的致癌功能，使用两种shRNA沉默了ALKBH3的表达（图2A-B）。结果发现，ALKBH3缺失的细胞中m1A水平明显升高（图2C）。此外，在所有测试的眼黑色素瘤细胞中，ALKBH3沉默导致细胞生长（图2D）和聚集能力（图2E-F）显著减弱。此外，如Transwell试验所示，敲除ALKBH3会导致迁移能力下降（图2G-H）。这些数据证明了ALKBH3是眼黑色素瘤体外恶性增殖和转移的必要致癌因子。为了评估它们在体内形成肿瘤的能力，将对照组和ALKBH3沉默的92.1黑色素瘤细胞（荧光素酶标记）注射到裸鼠体内，并在原位异种移植模型中监测肿瘤的生长。生物发光成像显示，ALKBH3缺陷眼黑色素瘤细胞的信号强度比对照细胞弱（图2I）。此外，ALKBH3沉默组的异种移植物平均重量减少了80%（图2J）。综上所述，这些实验表明ALKBH3在体外和体内眼黑色素瘤的肿瘤发生过程中起着致癌作用。

图二：敲除ALKBH3可提高m1A水平并抑制眼黑色素瘤的发生

3. 组蛋白乳酸化增强了ALKBH3的过度表达

为了确定ALKBH3表达增加的分子基础，研究人员查询了TCGA数据库，筛选与ALKBH3表达模式相似的基因。根据GO和KEGG分析，发现ALKBH3相关基因富集在多个代谢过程中，包括氧化磷酸化、细胞代谢过程和碳水化合物衍生物代谢过程。这表明ALKBH3 RNA表达的升高可能来自代谢重编程。此外，乳酸生成酶LDHA和LDHB与ALKBH3呈显著正相关，表明ALKBH3与乳酸之间存在关联（图3A-B）。由于之前的研究表明组蛋白乳酸化有助于激活癌基因，且眼部黑色素瘤的乳酸化水平升高，研究人员推测ALKBH3水平的升高可能与组蛋白乳酸化有关。

然后，研究人员验证了眼部黑色素瘤队列中泛乳酸化和组蛋白乳酸化标记（H3K18la）之间的表达模式，结果显示它们与ALKBH3蛋白的表达呈显著的正相关（图3B-C）。更重要的是，H3K18la的CUT&Tag和ChIP-seq分析都表明，在ALKBH3的启动子区域捕获到了强大的组蛋白乳酸化信号（图3D-E）。此外，组蛋白乳酸化抑制剂（草酸酯和2-DG）和LDHA/B抑制剂都会导致ALKBH3启动子区域的组蛋白乳酸化水平急剧下降（图3F），进而在所有测试的黑色素瘤细胞中消减ALKBH3的RNA（图3G）和蛋白水平（图3H-J）。

图三：组蛋白乳化可促进ALKBH3 的表达

4. 多组学筛选发现SP100A是ALKBH3的下游候选基因

随后探讨了沉默ALKBH3对眼部黑色素瘤细胞产生抑制作用的机制。由于ALKBH3负责去除RNA中的m1A修饰，首先对眼部黑色素瘤细胞和正常黑色素细胞进行了m1A-MeRIP-seq分析。结果表明，从正常细胞和肿瘤细胞产生的m1A-MeRIP-seq文库中分别鉴定出了平均16 864个和10 212个m1A峰（图4A和B）。与之前的m1A-meRIP-seq结果一致，m1A峰富集在5′UTR，尤其是起始密码子附近。值得注意的是，差异表达的m1A修饰基因与多个黑色素瘤相关通路有关，包括DNA复制、mTOR/AMPK信号转导和黑色素合成，这表明m1A修饰在眼部黑色素瘤的发病机制中起着调控作用。

此外，在沉默ALKBH3后，研究人员对92.1黑色素瘤细胞系进行了一系列全面的高通量筛选，包括m1A-MeRIP-seq（图4C）、RNA-seq（图4D-E）和黑色素瘤细胞系进行了蛋白质组分析（iTRAQ图4F）。同样，研究人员注意到，m1A修饰位点的变化明显富集于肿瘤相关通路，包括PI3K-Akt信号转导、病灶粘附和蛋白多糖合成（图4C）。此外，沉默ALKBH3导致基因表达水平发生了显著变化，上调基因达199个，下调基因达74个（图4D和E）。同样，蛋白质组水平也发生了巨大的变化（149个蛋白上调，67个蛋白下调，图4F），进一步强调了ALKBH3在眼部黑色素瘤发病机制中的重要性。

结合这些多组学数据，研究人员注意到沉默ALKBH3后，眼黑色素瘤细胞中的核自身抗原斑点蛋白100（SP100）在mRNA和蛋白质水平上都上调了，随后m1A修饰水平也发生了巨大变化（图4G-M）。值得注意的是，SP100负责PML核体的形成，主要作为各种癌症类型的肿瘤发生抑制因子，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌和喉癌。这一观察结果与在ALKBH3基因缺陷细胞中观察到的抑制效果相吻合。重要的是，与正常黑色素细胞相比，SP100在眼部黑色素瘤细胞中的m1A甲基化减少了。m1A-MeRIP-seq（图4I）和m1A-MeRIP-qPCR（图4J）都表明，眼黑色素瘤细胞中的m1A修饰水平在ALKBH3抑制后得到恢复。由于最近的研究观察到mRNA的m1A修饰会增强基因表达和翻译效力，因此ALKBH3介导的m1A修饰可能对肿瘤抑制因子SP100的表达至关重要。然后通过RNA-seq（图4K）和qPCR（图4L）验证了抑制ALKBH3后SP100在mRNA水平上显著上调。iTRAQ和Western blot检测（图4M）显示，SP100在ALKBH3抑制细胞中的蛋白水平也有所增加。综上所述，这些数据表明ALKBH3可能会通过去除其m1A修饰来抑制SP100的表达水平。

图四：lALKBH3通过去除SP100的m1A修饰抑制其表达

5.SP100A是眼部黑色素瘤的肿瘤抑制因子

在病毒感染反应中，SP100有四种主要亚型（即SP100A、SP100B、SP100C和SP100HMG），这促使研究人员对这些转录本的表达水平进行比较分析。值得一提的是，SP100A与SP100B、SP100C和SP100HMG在最初的15个外显子（1-1562bp）上表现出了共性，而在最后一个外显子上观察到了395bp的长度差异。从眼部黑色素瘤细胞（92.1）和正常黑色素细胞（PIG1）获得的RNA-seq数据显示，SP100A中的信号很突出，而SP100A未包含的外显子中的信号则可以忽略不计（图5A）。此外，还使用各种引物进行了qPCR。这些引物包括一组专为SP100A设计的引物（称为SP100-P1）和另一组检测SP100B、SP100C和SP100HMG的引物（称为SP100-P2）。在眼部黑色素瘤细胞和正常色素细胞中观察到了SP100A的RNA表达（图5B）。由于有报道称人类乳腺癌细胞株ZR-75-1表达SP100HMG，因此采用ZR-75-1细胞作为阳性对照。重要的是，只有在ZR-75-1中检测到SP100B/SP100C/SP100HMG，而在其他细胞株中未检测到。此外，这四种异构体的分子量也有差异。Western blot显示SP100A（∼72kDa）在所有检测的细胞系中都有特异性蛋白表达，这与之前研究中SP100A的分子量一致。这些结果表明，SP100A在实验环境中大量表达，而其他同工酶（SP100B、SP100C和SP100HMG）的表达则微乎其微。

通过RNA-seq（图5A）、qPCR（图5B）和Western blot检测（图5C）发现，与正常色素细胞相比，眼部黑色素瘤细胞中SP100A的RNA表达水平也明显下降。为了全面揭示SP100A在眼部黑色素瘤中的功能，研究人员测定了SP100A在眼部黑色素瘤临床样本中的表达，发现SP100A在眼部黑色素瘤样本中的表达量明显下降（图5D和E）。更重要的是，在研究人员的队列（图5F）和TCGA队列（图5G）中，SP100A的缺失都与不利的预后有关。

此外，根据眼部黑色素瘤样本的单细胞分析，SP100的表达与癌症激活标志得分的降低有关，包括侵袭、转移、细胞周期激活、增殖和上皮细胞向间质转化。总之，这些数据表明，SP100A在眼部黑色素瘤中被下调并可能抑制多种致癌事件。

由于SP100A在眼部黑色素瘤中下调，研究人员在三种眼部黑色素瘤细胞系中外源过表达了SP100A，过表达SP100A后，所有受测的眼黑色素瘤细胞的增殖能力都减弱了（图5H）。此外，与对照组相比，过表达SP100A的黑色素瘤细胞形成的菌落更小更少（图5I-J）。此外，在眼部黑色素瘤细胞中引入SP100A后，还观察到癌症转移能力受到明显抑制（图5K-L）。

最重要的是，由于SP100A是PML体内的分子支架，研究人员随后评估了SP100A过表达细胞中PML的表达情况。结果，外源过表达SP100A导致PML蛋白水平显著升高（图5M）。同时，免疫荧光分析表明，SP100A过表达细胞中PML体的存在明显增加。总之，这些数据进一步证实了SP100A对于PML的表达至关重要，这与之前的研究一致。此外，ALKBH3缺失的细胞表现出在PML小体中大幅升高，这与ALKBH3在调控SP100A表达中的关键作用一致。综上所述，这些功能增益数据揭示了SP100A负责PML核凝聚体的形成，是眼部黑色素瘤的肿瘤抑制因子。

图五：SP100A在眼部黑色素瘤中发挥肿瘤抑制因子的作用

6.沉默SP100A会部分影响ALKBH3缺陷细胞的抑瘤效果

为了进一步验证ALKBH3和SP100A表达之间的关系，通过转染一种针对SP100A的shRNA，进一步改变了眼部黑色素瘤细胞中ALKBH3抑制后SP100A的表达。不出所料，转染SP100A-shRNA到三个眼黑色素瘤细胞后，SP100A的表达在RNA和蛋白水平上都显著下降。在细胞生长过程中，SP100A的缺失部分（50%～60%）挽救了ALKBH3抑制作用（图6A），而且SP100A缺失的细胞对ALKBH3的抵抗力更强（图6A）。同样，SP100A沉默的细胞比对照组出现更多的菌落（图6B）。此外，抑制SP100A能显著增强细胞的迁移能力，并影响对ALKBH3缺陷黑色素瘤细胞的抑制效果（图6C）。最重要的是，SP100A的敲除进一步挽救了ALKBH3缺失黑色素瘤细胞的原位肿瘤形成（图6D和E）。同样，在野生型和ALKBH3 缺失型眼黑色素瘤细胞（图6F）中，稳定敲除SP100A会导致PML表达受损。这些结果表明，ALKBH3通过减少SP100A介导的体内和体外PML小体来促进眼黑色素瘤。

图六：SP100A沉默可部分阻断ALKBH3敲除的抗癌作用。

7.SP100A的m1A修饰增强了其RNA稳定性和翻译功效

随后探索了SP100A的m1A修饰的表观遗传机制。由于之前的研究表明YTHDF蛋白负责识别m1A甲基化，首先检测了SP100A mRNA与YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的结合情况。RNA免疫沉淀分析表明，YTHDF1能特异性地识别SP100A mRNA；然而，YTHDF2和YTHDF3仅表现出有限的相互作用强度（图7A）。此外，在TCGA队列中，YTHDF1与SP100A的表达呈显著正相关（图7B），这与YTHDF1是识别SP100A的必要条件这一假设完全吻合。此外，YTHDF1沉默可显著抑制SP100A的表达，并完全恢复了ALKBH3沉默介导的SP100A水平升高（图7C-D）。综上所述，这些数据表明YTHDF1是SP100A的阅读蛋白。

然后确定了SP100A mRNA的特定m1A修饰位点。在SP100A的5′UTR中，根据确定的峰值找到了五个潜在的m1A位点[c.44A（TGTGG）、c.54A（AGACG）和c.67A（TGAGG），以及c.92A/c.93A（GGAAG）]（图4I），并将每个A突变为T。然后将相应的野生型和突变的5′UTR 克隆到pmirGLO载体中（图7E）。荧光素酶报告基因检测表明，c.A92T的信号减弱，而其他突变组的信号保持不变（图7E）。此外还进行了RIP-qPCR分析，以确定YTHDF1与报告转录本（F-luc）之间的相互作用频率。观察到pmirGLO-MUT4(c.A92T)转录本与YTHDF1和F-Luc的结合亲和力下降，而其他转录本保持不变。这一结果与之前的观察结果一致，即YTHDF1直接与m1A甲基化序列相互作用，而m1A甲基化序列被认为是RNA中 m1A的"Reader"。此外还发现ALKBH3缺失的细胞中SP100A的RNA稳定性增强，这与ALKBH3缺失后SP100A RNA表达的增加相吻合（图7F）。重要的是，92.1细胞中的多聚体分析表明，稳定敲除ALKBH3会导致多聚体部分的SP100A mRNA丰度明显提高（图7G），而多聚体部分通常具有有效的翻译能力。这一观察结果与之前的结论一致，即早期外显子中的m1A修饰会增强翻译能力。值得注意的是，在敲除ALKBH3后，新生SP100A RNA的表达仍然没有改变。综上所述， SP100A mRNA的m1A RNA甲基化有助于提高转录后的RNA稳定性和翻译能力。

图七：SP100A的m1A修饰可增加其RNA的稳定性和翻译功效

实验方法：

ChIP-seq、CUT&Tag、Diot blot、免疫荧光技术、蛋白免疫印迹、蛋白质组学分析（LC-MS）、Transwell实验、MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-qPCR、荧光素酶实验、多聚核糖体分析

参考文献：

Gu X, Zhuang A, Yu J, Yang L, Ge S, Ruan J, Jia R, Fan X, Chai P. Histone lactylation-boosted ALKBH3 potentiates tumor progression and diminished promyelocytic leukemia protein nuclear condensates by m1A demethylation of SP100A. Nucleic Acids Res. 2023 Dec 20:gkad1193. doi: 10.1093/nar/gkad1193. Epub ahead of print. PMID: 38118002.