长链非编码RNA Malat1可预防骨质疏松和骨转移
骨质疏松症以骨密度降低、骨脆性增加和骨折易感性增加为特征，反映了破骨细胞骨吸收超过成骨细胞骨形成的不平衡，并加速骨转移。原发性骨质疏松发生在衰老过程中，尤其是绝经后女性。继发性骨质疏松与原发性骨质疏松的结局相同，但由某些疾病或药物引起。在这两种情况下，过度的破骨细胞生成起着关键作用，并为治疗干预提供了机会。破骨细胞是一类多核巨细胞（MGC），起源于单核/巨噬细胞谱系，负责骨基质和矿物质的吸收。破骨细胞的生成由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）启动，诱导破骨细胞标志物如组织蛋白酶K（CTSK）和酸性磷酸酶5（ACP5，也称为TRAP）的表达，随后破骨细胞前体成熟和细胞-细胞融合。作为破骨细胞生成的主要调节因子，活化T细胞核因子1（NFATC1）被RANKL诱导，进而与其他转录因子形成复合体，激活其编码基因以及其他参与破骨细胞黏附、细胞融合和骨吸收的基因的转录。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200个核苷酸且不翻译成蛋白质的转录本，通过与DNA、其他RNA和蛋白质结合发挥功能。lncRNA通常进化保守性较低。MALAT1是一个高度保守的核内长链非编码RNA，在的组织中大量表达。根据siRNA敲低培养细胞系的结果，MALAT1已被证明调节选择性前体mRNA剪接。然而，目前缺乏MALAT1改变在低BMD和骨质疏松中发挥作用的功能证据。该研究发表在《Nature Communications》，IF：16.6。
技术路线：
主要研究结果：
1. MALAT1在人类和小鼠破骨细胞分化过程中下调
CMPs可分化为单核细胞和巨噬细胞，是破骨细胞的前体。作者分析了人胎盘CD14+巨噬细胞向MGCs分化过程中的基因表达（图1a），其中破骨细胞是的主要细胞群。与CD14+巨噬细胞相比，MGCs中破骨细胞标志物的表达升高，包括NFATC1、CTSK、DCSTAMP、ATP6V0D2、ATP6V0E2和ATP6V0A1（图1b，c）。相反，相对于CD14+巨噬细胞，MALAT1在MGCs中显著下调（图1a-c）。与破骨细胞的功能一致，基因集富集分析表明，与CD14+巨噬细胞相比，在MGCs中富集的基因集与胶原组织、细胞外结构重塑和骨骼发育相关（图1d）。为了进一步验证Malat1在巨噬细胞向破骨细胞分化过程中的下调，作者用可溶性RANKL处理小鼠巨噬细胞/前破骨细胞细胞系RAW264.7，以诱导破骨细胞分化。在此处理后，破骨细胞的标志物，包括NFATC1，Ctsk和Trap5，以时间依赖性的方式上调（图1e-g），而Malat1的表达水平显著降低（图1h）。综上所述，这些结果揭示了MALAT1作为一个lncRNA在人类和小鼠的破骨细胞生成过程中下调。
脂多糖（LPS）和TNF-α参与病理性破骨细胞生成。与之前的报告一致，作者观察到单独的LPS处理不足以启动破骨细胞分化；相反，当RAW264.7细胞用RANKL预处理时，LPS处理促进了破骨细胞的生成，如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色所示（图1i，j），这是一种广泛使用的破骨细胞标志物（图1k），并上调了NFATC1和Ctsk的表达（图1k）。另一方面，TNF-α可以通过依赖和不依赖RANKL的方式诱导破骨细胞分化。事实上，作者发现用TNF-α处理RAW264.7细胞诱导的破骨细胞生成和NFATC1和Ctsk的表达，无论是否用RANKL预处理（图1i，l，m）。值得注意的是，Malat1在LPS或TNF-α诱导的破骨细胞分化过程中显著下调（图1k，m）。这些发现表明，Malat1可能参与对各种刺激做出反应的破骨细胞生成。
图1 MALAT1在破骨细胞分化过程中表达下调
2. 遗传模型显示Malat1可预防骨质疏松和骨转移
为了研究Malat1在破骨细胞生成和骨质疏松中的作用，作者使用了作者之前研究中描述的Malat1敲除小鼠模型（Malat1−/−），在Malat1的转录起始位点的下游插入一个转录终止子，导致Malat1 RNA表达的丢失，而不改变Malat1的邻近基因的表达水平。此外，作者之前在小鼠中构建了ROSA26基因座的Malat1转基因靶向表达（Malat1Tg/Tg)，这使作者能够通过产生Malat1−/−；Malat1Tg/Tg动物，在Malat1−/−小鼠中进行遗传拯救研究。作者收集了Malat1+/+，Malat1−/−，Malat1−/−小鼠的各种组织，包括骨髓，胃，结肠，小肠，肝脏和胰腺组织；Malat1Tg/Tg小鼠，通过qPCR检测Malat1的表达水平。
通过对6个月大的动物进行股骨微计算机断层扫描（μCT）分析，作者发现雄性和雌性Malat1−/−小鼠的骨密度比年龄和性别匹配的Malat1+/+小鼠低得多；重要的是，这种骨质疏松表型在Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠中得到了挽救（图2a，b）。μCT数据的定量显示，与Malat1+/+小鼠相比，骨小梁密度（图2c，d）在Malat1−/−小鼠中显著减少，并且这些减少在很大程度上被Malat1表达的遗传恢复所逆转（图2c，d）。TRAP染色显示，与Malat1+/+小鼠相比，Malat1−/−小鼠股骨中破骨细胞显著增加，并且这种增加在Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠中被逆转（图2e）。股骨破骨细胞的定量分析显示，相对于Malat1+/+小鼠，每骨周长的破骨细胞数量显著增加（图2f）和每骨表面的破骨细胞表面（图2g）在Malat1−/−小鼠中升高约2倍。
接下来，为了确定Malat1在调节骨病理性丢失中的作用，作者使用了一个成熟的炎症性骨吸收小鼠模型，包括向颅骨皮下注射LPS。μCT成像显示，与Malat1+/+或Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠相比，给8周龄的Malat1−/−小鼠注射LPS后，颅骨表面的骨质破坏显著加重（图2h，i）。TRAP染色和定量显示，注射LPS后，Malat1−/−小鼠的每骨周长有更高的破骨细胞数量（图2j，k）和更多的破骨细胞表面每骨表面（图2j，l），Malat1+/+或Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠。综上所述，这些发现表明Malat1缺乏促进生理和炎症条件下的骨质疏松。
图2 Malat1预防骨质疏松
未经治疗的骨质疏松症与的癌症患者骨转移加速相关。治疗骨质疏松的药物，如抑制破骨细胞介导的骨吸收的双膦酸盐，已被用于治疗骨疾病，包括骨转移。为了确定宿主中的Malat1是否对骨转移具有保护作用，作者将荧光素酶标记的B16F1黑色素瘤细胞注射到6个月大的雄性Malat1+/+，Malat1−/−，或Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠的胫骨中，作者发现宿主中的Malat1缺失显著加剧了骨转移，Malat1的重新表达挽救了这一表型。通过活体动物的生物发光成像（图3a）和解剖的骨骼（图3b，c），以及骨骼中可见肿瘤的肉眼检查进行测量（图3d）。
图3 Malat1保护黑色素瘤和乳腺肿瘤细胞的骨转移
鉴于骨是乳腺癌的常见转移部位，作者在3个月大的雌性Malat1+/+，Malat1−/−，和Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠的胫骨内注射EO771细胞系，EO771细胞系来源于C57BL/6背景下的小鼠乳腺肿瘤。注射2×105荧光素酶标记的EO771细胞后，3组动物在注射当天的生物发光信号基线水平无明显差异。在研究终点，作者观察到Malat1−/−小鼠的信号显著高于Malat1+/+和Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠（图3e）。安乐死后，作者收集胫骨进行离体成像（图3f，g），证实了在体成像结果。作者还对胫骨进行了x线成像，发现Malat1−/−小鼠有更多的溶骨性病变（图3h）。此外，骨切片的he染色显示，Malat1−/−小鼠的胫骨中有更高的肿瘤负荷，证据是靠近生长板的骨皮质中有更多的癌变，肿瘤区域更深地延伸到远端骨髓腔（图3i）。免疫组织化学染色RFP（与荧光素酶共表达）支持组织学分析（图3i）。此外，TRAP染色显示，与Malat1+/+和Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠相比，Malat1−/−小鼠胫骨中破骨细胞数量增加（图3j-1）。结合B16F1模型的结果，这些发现共同表明，宿主小鼠中Malat1的缺失加剧了黑色素瘤和乳腺癌细胞的转移性骨定植。
3. 骨质疏松、骨肉瘤或乳腺癌骨转移患者骨组织的单细胞转录组分析
为了评估MALAT1在骨质疏松和骨转移中的临床相关性，作者分析了人类骨组织的单细胞RNA-seq数据。数据集包括：GSE190772样本来自2例乳腺癌骨转移患者，GSE162454样本来自6例骨肉瘤患者，以及GSE169396特征为1例非骨质疏松个体和3例骨质疏松患者（髋关节置换术中采集的股骨头）的骨组织。骨肉瘤和乳腺癌骨转移常表现出溶骨性特征。
作者使用“和谐”法去除样本间的批间效应，随后应用降维法对基于标记基因的细胞类型进行注释。这些分析确定了不同患者组的细胞簇特异性转录组。然后，作者分析了非骨质疏松个体（图4a，b）、骨质疏松患者（图4c，d）、骨肉瘤患者（图4e，f）和乳腺癌骨转移患者（图4g，h）的前破骨细胞（包括单核细胞和巨噬细胞）和成熟破骨细胞中MALAT1的表达。在每组中，与前破骨细胞相比，MALAT1在破骨细胞中的表达水平显著降低（图4b，d，f，h）。骨质疏松、骨肉瘤或乳腺癌骨转移患者的前破骨细胞和破骨细胞中MALAT1的表达水平显著低于非骨质疏松个体（图4i-k）。这些发现表明，破骨细胞中MALAT1表达的降低与骨质疏松和骨病变相关，包括乳腺癌转移和骨肉瘤。
图4：骨质疏松症、骨肉瘤或乳腺癌骨转移患者骨组织的单细胞转录组分析
4. Malat1缺陷通过激活NFATC1促进破骨细胞生成
由于作者研究中使用的Malat1−/−和Malat1Tg/Tg动物是全身敲除和转基因小鼠，因此上述观察到的骨质疏松表型可能是也可能不是破骨细胞前体中Malat1缺失的直接影响。为了解决这个问题，作者从Malat1+/+，Malat1−/−，和Malat1−/−；Malat1Tg/Tg小鼠中分离出原代骨髓来源的巨噬细胞（BMMs），然后用M-CSF和RANKL处理这些破骨细胞前体4-6天，诱导其向破骨细胞分化。qPCR证实了BMMs中的基因消融和Malat1表达恢复（图5a）。在M-CSF和RANKL诱导分化后，作者通过TRAP染色检测破骨细胞，发现敲除Malat1导致TRAP阳性多核破骨细胞数量显著增加，而重新表达Malat1逆转了观察到的破骨细胞生成的诱导（图5b）。破骨细胞标志物Ctsk和Trap5的mRNA水平在Malat1−/−细胞中明显高于Malat1+/+和Malat1−/−；RANKL处理后Malat1Tg/Tg细胞（图5c，d）。
图5 Malat1缺陷通过NFATC1促进破骨细胞生成
作者还使用CRISPR干扰（CRISPRi）在细胞系中敲低Malat1。选取sgRNA-2和sgRNA-3在RAW264.7细胞中敲低Malat1，并通过qPCR进行验证（图5e），得到的两个敲低Malat1的稳定细胞株分别命名为Malat1 KD1和Malat1 KD2。RANKL诱导分化后，Malat1 KD1和Malat1 KD2细胞比对照RAW264.7细胞产生更多的trap阳性多核破骨细胞（图5f）。鬼笔环肽和DAPI分别对F-actin环和细胞核进行荧光染色，结果显示Malat1 KD1和Malat1 KD2细胞的每个破骨细胞的细胞核数量高于对照细胞（图5g）。此外，在RANKL处理的RAW264.7细胞中，敲低Malat1可以上调Ctsk和Trap5的mRNA水平（图5h，i）。总的来说，原代骨髓基质细胞和RAW264.7细胞的结果表明，破骨细胞前体中Malat1的缺失促进了RANKL诱导的破骨细胞生成。
接下来，作者将RANKL刺激时间延长至2天和5天，发现Malat1缺乏不影响Mitf、Erk1/2、c-Fos、IκBα、Creb1和p38的水平。另一方面，与Malat1+/+和Malat1−/−；Malat1Tg/Tg骨髓基质细胞相比，Malat1敲除骨髓基质细胞更多地诱导了NFATC1及其转录靶Ctsk（图5j）。作者在RANKL处理的Malat1 KD1和Malat1 KD2 RAW264.7细胞中观察到类似的结果（图5k）。已知NFATC1作为其自身的转录因子发挥作用。与Malat1野生型相比，Malat1敲除的BMMs和RAW264.7细胞在RANKL刺激后显示出更多的NFATC1 mRNA水平的诱导（图5l，m）。Ctsk，一个经典的NFATC1靶基因，包含两个NFATC1结合位点在启动子区域（图5n）。染色质免疫沉淀-qPCR检测显示，在RANKL处理后，Malat1敲低的RAW264.7细胞显示NFATC1占据了比对照RAW264.7细胞更多的这两个区域（图5o，p）。重要的是，在敲低Malat1的RAW264.7细胞中，敲低NFATC1逆转了RANKL刺激下对破骨细胞生成和Ctsk表达的诱导（图5q，r）。综上所述，这些结果表明Malat1缺失通过NFATC1促进破骨细胞分化。
作者还试图确定Malat1过表达的影响。Malat1是一种高度富集的lncRNA，作者通过多种方法进行了测试，并仅通过piggyBac转座子系统和电穿孔在RAW264.7细胞中过表达Malat1。在野生型细胞和小鼠中实现显著的Malat1过表达的挑战限制了对其过表达效应的全面研究。然而，考虑到前破骨细胞和破骨细胞中MALAT1表达的减少与骨质疏松和骨转移相关（图4i-k），作者的功能缺失方法，再加上MALAT1在MALAT1缺陷小鼠和细胞系中的重新表达，适合于这项研究。
5. Malat1结合TEAD3抑制NFATC1活性和破骨细胞生成
Malat1如何调控NFATC1与其他蛋白的结合可以激活或抑制NFATC1的转录活性，而lncRNA通常通过与蛋白的相互作用来发挥其功能，Malat1已经证明了这种作用模式。作者推测Malat1可能通过与NFATC1和/或其结合蛋白相互作用来调节NFATC1的自动扩增环路，因此作者搜索了蛋白质-蛋白质相互作用数据库Mentha（http://mentha.uniroma2.it/index.php）。
作者检测了4个Tead家族成员在BMMs和RAW264.7细胞以及其他几种小鼠细胞系中的蛋白水平。有趣的是，Tead1和Tead共激活因子Yap在BMMs和RAW264.7细胞中不可测，但在小鼠黑色素瘤细胞系B16F1、小鼠胚胎成纤维细胞、MSC和小鼠成纤维细胞系L929中大量表达（图6a）。相反，TEAD3在原发性骨髓基质细胞中表现出相对特异性的表达模式。为了确定前破骨细胞中Malat1是否与NFATC1相互作用，作者进行了RIP检测，发现Malat1在RAW264.7细胞的pan-Tead和TEAD3免疫沉淀中均富集（图6b，c），这验证了在这些破骨细胞前体中Malat1和TEAD3之间的相互作用。为了确定Malat1是否直接结合TEAD3，作者对Malat1的6个非重叠的生物素化片段，作者发现所有6个Malat1片段，而不是一个无关的核RNA U1，都与TEAD3蛋白结合（图6d），这表明TEAD3结合位点可能弥漫性分布在Malat1上。
图6 Malat1与TEAD3结合抑制NFATC1活性
有趣的是，RAW264.7和U937细胞的RANKL处理上调了TEAD3，但没有上调其他Tead家族成员（图6e，f）。免疫共沉淀（co-IP）实验表明，TEAD3，而不是Yap，与NFATC1相互作用（图6g）。在验证TEAD3与Malat1和NFATC1的相互作用后，作者试图确定Malat1是否调节TEAD3与NFATC1的结合。为此，作者产生了Malat1敲除的HEK293T细胞，并将TEAD3和NFATC1转染这些细胞。Co-IP检测表明，Malat1缺失显著增加了TEAD3和NFATC1之间的相互作用（图6h，i）。为了进一步证实这一结果，作者在Malat1敲除的HEK293T细胞中重新表达Malat1，发现恢复Malat1表达降低了TEAD3-NFATC1的相互作用（图6j，k）。
NFATC1蛋白包含四个结构域:n端和c端区域的两个转录激活结构域（TAD）、一个中央DNA结合结构域（DBD）和一个n端调节结构域（图6l）。TEAD3蛋白主要由两个结构域组成：n端DBD（也称为TEA结构域）和c端yap结合结构域。因此，作者产生了NFATC1和TEAD3的截短突变体（图6l），并进行了co-IP检测，发现Nfact1的n端区域和中央DBD，而不是Nfact1的c端TAD，可以结合TEAD3（图6m）。此外，使用TEAD3截短突变体和全长NFATC1进行的co-IP分析表明，TEAD3的TEA结构域，而不是yap结合结构域，负责与NFATC1的相互作用（图6n）。
作者进一步研究了Malat1和TEAD3是否调节NFATC1的转录活性，通过使用包含串联NFATC1结合位点或Ctsk启动子的荧光素酶报告，作者发现TEAD3的过表达确实增强了NFATC1的转录活性（图6o，p）。作者发现，与野生型或Malat1挽救的细胞相比，在Malat1敲除细胞中，TEAD3过表达导致NFATC1活性出现更高的剂量依赖性增加（图6q，r）。这些结果支持以下模型：Malat1缺失解除对TEAD3的抑制，而TEAD3进而结合并激活NFATC1。
利用CRISPR激活方法激活RAW264.7细胞内源性TEAD3表达（图7a、b），作者发现过表达TEAD3促进了破骨细胞分化（图7c、d），上调了NFATC1、Trap5和Ctsk的表达（图7e-h）。接下来，作者在RAW264.7细胞中敲低TEAD3（图7i），发现敲低TEAD3减弱了RANKL诱导的破骨细胞分化（图7j，k），并下调了NFATC1和Ctsk的表达（图7l）。此外，在敲除Malat1的RAW264.7细胞中，沉默TEAD3可以抵消RANKL介导的破骨细胞生成和NFATC1和Ctsk表达的诱导（图7m-p）。因此，Malat1缺失以TEAD3和NFATC1依赖的方式促进破骨细胞分化。
图7 TEAD3促进破骨细胞生成并介导Malat1缺陷的作用
结论：
该研究发现Malat1在人类和小鼠的破骨细胞生成过程中下调。值得注意的是，小鼠中Malat1的缺失促进了骨质疏松和黑色素瘤和乳腺肿瘤细胞的骨转移，而Malat1的基因反加可以挽救这一过程。机制上，Malat1与TEAD3蛋白结合，阻断TEAD3与NFATC1的结合和激活，从而抑制NFATC1介导的基因转录和破骨细胞分化。值得注意的是，临床骨样本的单细胞转录组分析表明，前破骨细胞和破骨细胞中MALAT1表达的降低与骨质疏松和转移性骨病变相关。综上所述，这些发现证实了Malat1是一个可以预防骨质疏松和骨转移的lncRNA。
实验方法：
基因工程小鼠模型，LPS诱导的炎性骨质疏松模型，μCT骨扫描和分析，骨转移测定，骨组织组织学，TRAP染色，甲苯胺蓝染色，免疫组织化学染色，骨组织钙黄绿素染色，细胞培养，破骨细胞分化，成骨细胞分化，肌动蛋白环染色，质粒，慢病毒转导，Malat1敲低、敲除和过表达，TEAD3敲低和过表达，RNA干扰，免疫沉淀，免疫印迹，RNA提取，cDNA合成，定量PCR，RT-PCR，染色质免疫沉淀分析，RNA pulldown，RIP，荧光素酶报告基因检测，酶联免疫吸附实验，批量RNA测序分析，单细胞RNA-seq分析
参考文献：
Zhao Y, Ning J, Teng H, Deng Y, Sheldon M, Shi L, et al. Long noncoding RNA Malat1 protects against osteoporosis and bone metastasis. Nat Commun. 2024 Mar 16;15(1):2384. doi: 10.1038/s41467-024-46602-3. PMID: 38493144; PMCID: PMC10944492.